【摘要】：目的： 用多組分反應(yīng)(MCRs)合成四氫嘧啶類化合物PL-1215,并探討其鎮(zhèn)痛活性及其作用機制。 方法： (1)四氫嘧啶類化合物PL-1215的合成：以丁炔二乙酸二甲酯、甲醛、環(huán)戊胺為原料,冰醋酸為催化劑,乙醇為溶劑,采用多組分反應(yīng)法合成四氫嘧啶類化合物PL-1215,以薄層色譜法(TLC)檢測反應(yīng)的進(jìn)度,通過重結(jié)晶或柱層析法對粗產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。通過質(zhì)譜(MS)、碳譜(13C-NMR)和核磁共振氫譜(1H-NMR)分析確認(rèn)PL-1215的結(jié)構(gòu)。 (2)四氫嘧啶類化合物PL-1215的鎮(zhèn)痛活性研究： 1)通過小鼠醋酸扭體實驗,觀察PL-1215的鎮(zhèn)痛作用：取BALB/c小鼠50只,均分為5組,分別為溶媒對照組(0.1%CMC-Na:20ml/kg, i.g.),曲馬多陽性對照組(10mg/kg, i.g.)及PL-1215高中低劑量組(90mg/kg,30mg/kg,10mg/kg, i.g.),給藥后1h,按0.1ml/10g.b.w腹腔注射給以新配的0.7%醋酸生理鹽水液。觀察并記錄給以醋酸刺激后小鼠20min內(nèi)的扭體次數(shù)。 2)通過福爾馬林致痛實驗,觀察PL-1215的鎮(zhèn)痛作用：取SD大鼠40只,均分為5組,分別為模型組(0.1%CMC-Na:20ml/kg, i.g.),曲馬多陽性對照組(10mg/kg,i.g.)及PL-1215高中低劑量組(90mg/kg,30mg/kg,10mg/kg, i.g.),給藥后30min,于各組大鼠右后足背皮下分別注射50μl2%福爾馬林溶液。觀察并記錄0-5min及15-30min內(nèi)大鼠舔、咬右后足的時間。 3)通過熱板法實驗,觀察PL-1215的鎮(zhèn)痛作用：取BALB/c小鼠50只,均分為5組,分別為溶媒對照組(0.1%CMC-Na:20ml/kg, i.g.),曲馬多陽性對照組(10mg/kg,i.g.)及PL-1215高中低劑量組(90mg/kg,30mg/kg,10mg/kg, i.g.),于給藥前并于給藥后0.5h測定痛閾,以小鼠足部接觸熱板到開始舔后足的時間為痛閾(s),以連續(xù)測3次(每次間隔5min)舔足潛伏期的平均值為痛閾。 4)通過大鼠光照甩尾實驗,觀察PL-1215的鎮(zhèn)痛作用：取SD大鼠40只,均分為5組,分別為溶媒對照組(0.1%CMC-Na:20ml/kg,i.g.),曲馬多陽性對照組(10mg/kg, i.g.)及PL-1215高中低劑量組(90mg/kg,30mg/kg,10mg/kg, i.g.),用聚光燈照射大鼠尾部皮膚致痛,甩尾潛伏期為由輻射開始到鼠尾擺動的時間,單位為秒(s)。以連續(xù)測3次(每次間隔5min)甩尾潛伏期的平均值為痛閾。于給藥前30min及給藥后30min測定大鼠痛閾。 5)以醋酸扭體實驗為模型,通過測定小鼠脊髓c-fos蛋白及c-fos mRNA的表達(dá),觀察PL-1215的鎮(zhèn)痛作用：取BALB/c小鼠24只,均分為4組,分別為溶媒對照組(0.1%CMC-Na:20ml/kg,i.g.),模型組(0.1%CMC-Na:20ml/kg, i.g.),曲馬多陽性對照組(10mg/kg,i.g.)及PL-1215組(30mg/kg, i.g.),給藥1h后,按O.lml/lOg.b.w腹腔注射給以新配的0.7%醋酸生理鹽水液進(jìn)行刺激(后3組),20min后,小鼠頸椎脫臼處死,取脊髓,用western blot測定小鼠脊髓c-fos的表達(dá),用實時定量PCR(qPCR)測定小鼠脊髓c-fos mRNA的表達(dá),記錄實驗結(jié)果。 (3)四氫嘧啶類化合物PL-1215的鎮(zhèn)痛機制研究： 1)以醋酸扭體實驗為模型,將60只小鼠均分為兩大組,兩大組又各分為3小組,每組10只,分別灌胃給以0.5%CMC-Na,PL-1215(30mg/kg),灌胃給以曲馬多(10mg/kg)作為陽性對照組,一大組于給藥前15min皮下注射給以納諾酮,而另一組則不給以納洛酮處理,觀察納洛酮對PL-1215鎮(zhèn)痛作用的影響。 2)以醋酸扭體實驗為模型,將60只小鼠均分為兩大組,兩大組又各分為3小組,每組10只,分別灌胃給以0.5%CMC-Na、PL-1215(30mg/kg)、L-NAME (37.5mg/kg),一大組于給藥前20min灌胃給以L-Arg(100mg/kg),而另一組則不以L-Arg處理,觀察NO對PL-1215鎮(zhèn)痛作用的影響。 3)以醋酸扭體實驗為模型,將50只小鼠均分為5組,不同組分別給以CaCl2(30mg/kg,i.p.),EGTA(70mg/kg,i.p.), PL-1215(30mg/kg,i.g.),PL-1215+CaCl2(30mg/kg,i.p.), PL-1215+EGTA(70mg/kg,i.p.),觀察Ca2+對PL-1215鎮(zhèn)痛作用的影響。 4)以醋酸扭體實驗為模型,將60只小鼠均分為兩大組,兩大組又各分為3小組,每組10只,分別灌胃給0.1%CMC-Na、PL-1215(30mg/kg),腹腔注射給以氯丙咪嗪(10mg/kg),一組于給藥24h前腹腔注射給以利血平(5mg/kg),而另一組則不以利血平處理,觀察PL-1215對體內(nèi)不同部位單胺類遞質(zhì)的影響。 5)以醋酸扭體實驗為模型,將30只小鼠均分為3組,正常組、模型組及實驗組,分別灌胃給以0.5%CMC-Na(前兩組),PL-1215(30mg/kg),通過熒光分光光度法測定比較不同組小鼠腦干中的單胺類遞質(zhì)NA、DA、5-HT的含量,從而推斷PL-1215是否通過影響血液或腦干中的單胺類遞質(zhì)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,同時提示PL-1215可能的作用部位,然后采用實時定量PCR測定PL-1215對醋酸致痛20min后腦干中TPH mRNA、TH mRNA表達(dá)的影響,更深入地揭示其可能的作用機制。 (4)四氫嘧啶類化合物PL-1215的成癮性研究：連續(xù)灌胃小鼠待試藥物35天,每天1次,末次給藥后2h,先稱體重,然后腹腔注射納絡(luò)酮(5mg/kg),將小鼠放入直經(jīng)為30cm的圓桶內(nèi),觀察10分鐘內(nèi)小鼠跳躍和直立行為的次數(shù)；30分鐘時,再稱體重一次。跳躍、直立行為的次數(shù)越多以及體重下降越明顯提示成癮性越強。 (5)四氫嘧啶類化合物PL-1215的急性毒性研究：采用健康小鼠,體重20.0±2.0g,雌雄各30只,隨機分成六組,每組雌雄各占5只,經(jīng)口灌胃一次性給以PL-1215,劑量分別為6000、5390、4840、4340、3900、3500mg/kg,記錄小鼠毒性反應(yīng)情況和死亡動物分布,以Bliss統(tǒng)計法測定LD50值。 結(jié)果： (1)反應(yīng)經(jīng)2h完成,反應(yīng)產(chǎn)物為淡黃色液體,濃縮后,可通過柱層析法(流動相：石油醚：乙酸乙酯=10：1-2：1)分離提純得到目標(biāo)產(chǎn)物,亦可放入4℃冰箱通過重結(jié)晶獲得目標(biāo)產(chǎn)物,目標(biāo)產(chǎn)物(PL-1215)為白色固體,產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜(MS)、碳譜(13C-NMR)和核磁共振氫譜(1H-NMR)分析確認(rèn)(化學(xué)名：1,3-二環(huán)戊基-1,2,3,6-四氫嘧啶-4,5-二甲酸二甲酯)。反應(yīng)條件為,各組分物質(zhì)的量之比：丁炔二酸二甲酯：環(huán)戊胺：甲醛：乙酸=1：2：3：2；溶劑：乙醇；投料方式：先加環(huán)戊胺和丁炔二酸二甲酯于乙醇中預(yù)反應(yīng)30min,再加入環(huán)戊胺、甲醇、乙酸的混合液反應(yīng)1.5h；反應(yīng)溫度：室溫。在該反應(yīng)體系下,產(chǎn)率為79.5%。 (2)醋酸扭體實驗中,PL-1215高中低劑量組及陽性對照組均能明顯減少小鼠的扭體次數(shù),與模型組相比有顯著性差異；福爾馬林致痛實驗中,PL-1215高中低劑量組及陽性組能減少第一階段和第二階段大鼠添或咬腳的時間,對第一階段的作用更為明顯；熱板實驗中,PL-1215高中劑量及陽性組能明顯抑制由高溫刺激所引起的痛覺反應(yīng),與模型組相比有顯著性差異；光照甩尾實驗中,PL-1215高中低劑量及陽性組能明顯抑制由輻射熱傷害所引起的大鼠痛覺反應(yīng),與模型組相比有顯著性差異。醋酸組c-fos和c-fos mRNA表達(dá)量顯著增多,與正常組相比有顯著性差異,PL-1215組和陽性組c-fos和c-fos mRNA表達(dá)量明顯減低,與醋酸組相比有顯著性差異。 (3)四氫嘧啶類化合物PL-1215可能的鎮(zhèn)痛機制： 1)經(jīng)比較,納洛酮能顯著降低曲馬多的鎮(zhèn)痛作用,但對PL-1215的鎮(zhèn)痛作用沒有明顯阻斷作用。 2)經(jīng)比較,L-Arg能顯著降低L-NAME的鎮(zhèn)痛作用,但對PL-1215的鎮(zhèn)痛作用沒有明顯影響。 3)經(jīng)比較,CaCl2, EGTA對PL-1215的鎮(zhèn)痛作用均無明顯影響。 4)經(jīng)比較,利血平不僅能顯著降低氯丙咪嗪的鎮(zhèn)痛作用,也能明顯降低PL-1215的鎮(zhèn)痛作用。 5)通過測定表明,PL-1215能顯著提高醋酸處理后小鼠腦干中5-HT的量,但對DA僅有微弱的影響,對NA基本沒有影響。實時定量PCR測定表明,PL-1215能顯著提高醋酸處理后小鼠腦干中TPH mRNA,TH mRNA的表達(dá),與醋酸組相比有顯著性差異。 (4)經(jīng)長期給藥后,曲馬多組體重明顯減輕,跳躍、直立行為次數(shù)明顯增多,和模型組相比有顯著性差異,而PL-1215組體重?zé)o明顯減輕,跳躍、直立行為次數(shù)亦無明顯增多,和模型組相比無顯著性差異。 (5)通過測定,小鼠灌胃LD5o為4849mg/kg,95%可信區(qū)間為4323-5439mg/kg;是中等有效劑量的100多倍。 結(jié)論： (1)以丁炔二酸二甲酯、環(huán)戊胺和甲醛為原料,乙酸為催化劑,乙醇為溶劑,通過多組分反應(yīng)(MCRs),經(jīng)氫氨化、aza-ene類型反應(yīng)、親核加成、以及脫水環(huán)化等一系列多米諾反應(yīng)合成四氫嘧啶類化合物PL-1215,目標(biāo)產(chǎn)物可經(jīng)硅膠柱層析(流動相：石油醚：乙酸乙酯=10：1～2：1)或結(jié)晶法分離純化獲得,所得產(chǎn)物為白色固體。該法具有操作簡單、產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境友好等優(yōu)點。 (2)PL-1215能顯著減少醋酸扭體實驗中小鼠的扭體次數(shù),提示其可能具有抗炎鎮(zhèn)痛作用；PL-1215能顯著的減少福爾馬林實驗中第一階段大鼠添、咬腳時間,而對第二階段的影響弱于第一階段,提示鎮(zhèn)痛作用可能為中樞鎮(zhèn)痛；PL-1215能顯著抑制由熱板刺激所引起的小鼠痛覺反應(yīng)及由輻射熱傷害所引起的大鼠痛覺反應(yīng),進(jìn)一步提示其鎮(zhèn)痛作用可能為中樞鎮(zhèn)痛。PL-1215能顯著減少醋酸刺激小鼠c-fos及c-fos mRNA的表達(dá),從分子角度提示其鎮(zhèn)痛作用。 (3)四氫嘧啶類化合物PL-1215可能的鎮(zhèn)痛機制： 1)納洛酮對PL-1215的鎮(zhèn)痛作用基本無阻斷作用,提示PL-1215不是通過激動阿片受體而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的。 2) L-Arg對PL-1215的鎮(zhèn)痛作用無明顯影響,提示PL-1215不是通過NO-cGMP-ATP通路發(fā)揮作用的。 3) CaCl2, EGTA對PL-1215的鎮(zhèn)痛作用均無明顯影響,提示PL-1215亦不是通過Ca2+而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的。 4)利血平能顯著降低PL-1215的鎮(zhèn)痛作用,提示PL-1215可能是通過影響體內(nèi)單胺類遞質(zhì)的水平而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的。 5)PL-1215能顯著提高醋酸處理后小鼠腦干中5-HT的量,對DA有一定影響,對NA基本沒有影響,提示PL-1215可能是通過提高腦干5-HT、DA的表達(dá)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的；PL-1215能顯著提高醋酸處理后小鼠腦干中TPHmRNA的表達(dá),提示PL-1215可能是通過影響5-HT合成酶,進(jìn)而影響5-HT的合成而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的。 (4)經(jīng)長期給藥后,曲馬多組出現(xiàn)了弱的成癮性,說明模型可靠,而PL-1215組未出現(xiàn)明顯的戒斷癥狀,提示其成癮性極低。 (5)經(jīng)測定,小鼠灌胃LDso為4849mg/k,95%可信區(qū)間為4323～5439mg/kg;是中等有效劑量的100多倍,提示PL-1215毒性低,安全性好。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R965

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉和莉;李月玲;薛永志;;不同溫度和醋酸濃度對小鼠扭體疼痛模型的影響[J];包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2006年02期

2 DAWN A.,MARCUS M.D.,肇麗群;非惡性慢性疼痛的處理[J];中國實用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志;2004年05期

3 張穎;孫操;關(guān)慶超;楊靜偉;趙晶巖;;北豆根抗炎鎮(zhèn)痛作用的實驗研究[J];現(xiàn)代藥物與臨床;2009年06期

4 黃慶彰;羅紹賢;;小鼠熱板法的改進(jìn)[J];廣西醫(yī)學(xué);1986年04期

5 張琳琳;陳蘭妹;劉斯婕;宋愛華;胡春;;4-(2-呋喃基)-2-硫代-1,2,3,4-四氫嘧啶-5-羧酸酯類化合物的合成及其鈣拮抗活性[J];精細(xì)化工中間體;2008年02期

6 趙繼軍,魯彩霞,徐洪亞,庹焱;門診及住院急慢性疼痛患者疼痛情況調(diào)查分析[J];解放軍護理雜志;2002年01期

7 楊旅軍;老年人慢性疼痛的治療[J];老年醫(yī)學(xué)與保健;2005年03期

8 田明清;高崇榮;;淺談疼痛的分類與總合[J];疼痛;2003年01期

9 胡然,庫寶善,朱素君,賈永蕊,張永鶴,姚海燕;貫葉連翹提取物和鹽酸賴氨酸復(fù)方的鎮(zhèn)痛作用研究[J];中國臨床康復(fù);2003年26期

10 張黎,趙春暉,陳志武,王瑜,方明,江勤,岑德意,潘見;銀杏葉總黃酮鎮(zhèn)痛作用及機制的探討[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2001年04期

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1 朱秋華;含氮雜環(huán)化合物的多組份反應(yīng)合成及其生物活性研究[D];華南理工大學(xué);2010年

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本文編號：2329176