【摘要】：目的:杜興肌肉萎縮癥是一種致死性的伴X染色體遺傳的神經(jīng)肌肉疾病,是由dystrophin基因突變導(dǎo)致dystrophin蛋白缺失而引起,目前在臨床上還沒有有效的治療方法。盡管不同的基因治療方法取得不同程度的進(jìn)展,但都存在一定的局限性。其中,反義寡核苷酸干預(yù)前體RNA拼接過程的療法被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的療法之一。目前已有兩種不同結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn),但二者都存在系統(tǒng)運(yùn)輸效率低、用藥量大以及在心臟中作用效果有限的問題。因此,亟需研發(fā)新型運(yùn)輸輔助劑來提高反義寡核苷酸藥物的系統(tǒng)運(yùn)輸效率,從而增強(qiáng)藥效及減少用藥量。5%葡萄糖已在臨床上被長期廣泛使用,本課題組在研究中,發(fā)現(xiàn)葡萄糖及其他碳水化合物均能提高反義寡核苷酸PMO的活性。基于這一發(fā)現(xiàn),本課題對碳水化合物對反義寡核苷酸藥物活性的影響展開系統(tǒng)研究,并深入地闡釋碳水化合物的作用機(jī)理。方法:1.碳水化合物與PMO在mdx小鼠上的局部和系統(tǒng)測試:首先將不同碳水化合物分別與PMO混合,在杜興肌肉萎縮癥疾病模型-mdx小鼠上,經(jīng)局部和系統(tǒng)測試,利用IHC、RT-PCR及Western blot方法,以確定最佳候選輔助劑;通過在mdx小鼠上系統(tǒng)測試glucose/fructose(GF)與低于系統(tǒng)有效劑量的PMO的作用效果,以確定GF對是否能降低PMO系統(tǒng)有效劑量;按50mg/kg劑量,對PMO-GF在mdx小鼠上進(jìn)行長期系統(tǒng)測試,分別從dystrophin蛋白表達(dá)水平、mdx小鼠肌肉的病理狀態(tài)及肌肉功能恢復(fù)和安全性等方面進(jìn)行系統(tǒng)評估。2.對GF作用機(jī)理的闡釋:為確定GF是否通過增強(qiáng)PMO跳讀頻率或細(xì)胞攝取而起作用,將PMO和GF分別注射于mdx小鼠同一個(gè)前脛骨肌,時(shí)間間隔16h;另外,將GF與Lissamine標(biāo)記的PMO在mdx小鼠上進(jìn)行系統(tǒng)注射,利用小動物活體成像系統(tǒng)檢測不同組織中熒光強(qiáng)度,以確定GF的作用方式;通過利用GF不同光學(xué)異構(gòu)體、不同濃度GF以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受體抑制劑phloretin,以確定GF跨膜運(yùn)輸對其功能性的影響;同樣,使用GF類似物2-DG和敲減PFK表達(dá)水平等方法,以確認(rèn)GF代謝對其功能性的影響;利用ATP合成酶抑制劑oligomycin A、ATP注射和系統(tǒng)尾靜脈注射GF并局部注射PMO等試驗(yàn),以確認(rèn)能量與GF功能性的關(guān)系;并利用細(xì)胞模型,對PMO在細(xì)胞上的攝取途徑及GF作用機(jī)理進(jìn)行了確認(rèn);在C57BL6和SOD1G93A兩種小鼠模型對GF展開系統(tǒng)測試,以確定GF是否適用于其他能量缺乏小鼠模型。3.GF對其他核酸類藥物的作用效果:分別將GF與肽修飾PMO、2’OMe和GAPDH si RNA在mdx小鼠上進(jìn)行系統(tǒng)測試,利用IHC、RT-PCR、Western blot和小動物活體成像等方法確認(rèn)GF對其他核酸類藥物的作用效果。結(jié)果:1.碳水化合物與PMO在mdx小鼠上的局部和系統(tǒng)測試結(jié)果。對PMO與不同碳水化合物在mdx小鼠上局部和系統(tǒng)篩選結(jié)果:發(fā)現(xiàn)GF對PMO活性增強(qiáng)效果最佳。GF與50mg/kg PMO在mdx小鼠上的短期和長期系統(tǒng)測試結(jié)果,發(fā)現(xiàn)GF能夠顯著降低PMO系統(tǒng)有效劑量;長期使用GF能夠顯著提高PMO活性和dystrophin蛋白表達(dá)水平,改善mdx小鼠肌肉病理狀態(tài)和肌肉功能,且未檢測到任何毒副作用。2.對GF作用機(jī)理的闡釋結(jié)果。PMO跳讀頻率和體內(nèi)分布試驗(yàn)結(jié)果表明:GF增加PMO在mdx小鼠肌肉中的細(xì)胞攝取率,而對PMO跳讀頻率無影響。L型GF和葡糖糖轉(zhuǎn)運(yùn)受體抑制劑phloretin顯著降低PMO活性;而GF濃度超過5%后,其增強(qiáng)PMO活性和dystophin蛋白表達(dá)水平達(dá)到飽和,表明跨膜運(yùn)輸影響GF功能性。GF類似物2-DG不能提高PMO的活性;敲低GF代謝過程中關(guān)鍵酶PFK表達(dá),GF功效顯著減弱,表明GF分解代謝影響其功能性。ATP合成酶抑制劑oligomycin A能夠顯著抑制GF的功能性;同時(shí),GF和ATP共注射,對PMO活性無明顯的協(xié)同效應(yīng),說明GF是通過代謝產(chǎn)能而產(chǎn)生功效;尾靜脈系統(tǒng)注射高劑量GF,可顯著提高局部注射PMO的活性;PMO-GF長期治療的mdx小鼠肌肉中能量狀態(tài)得到明顯改善,這些結(jié)果說明GF是通過代謝產(chǎn)能,進(jìn)而改善細(xì)胞中能量狀態(tài)而發(fā)揮功效。在細(xì)胞模型上進(jìn)一步確認(rèn),PMO是通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用方式進(jìn)入細(xì)胞,GF代謝產(chǎn)能可提高PMO的細(xì)胞攝取;在其他模型上的系統(tǒng)測試結(jié)果表明:GF適用于其他能量缺乏的疾病模型。3.GF與其他核酸類藥物在mdx小鼠系統(tǒng)測試結(jié)果顯示:GF可顯著提高2’OMe、si RNA和R-PMO在骨骼肌中的攝取和活性。結(jié)論:1.本研究首次證明碳水化合物可作為核酸類藥物的運(yùn)輸輔助劑。2.通過對不同碳水化合物局部及系統(tǒng)篩選測試,確定GF對PMO作用效果最佳,并能顯著降低PMO系統(tǒng)有效劑量。3.通過在mdx小鼠上對PMO-GF長期系統(tǒng)測試,證明GF是一種安全、高效的運(yùn)輸輔助劑,且長期使用作用效果更為顯著。4.通過系統(tǒng)的體內(nèi)和體外機(jī)理試驗(yàn),證明GF是通過分解代謝產(chǎn)能,改善mdx小鼠肌肉中的能量狀態(tài),從而提高肌肉中PMO攝取率和活性。5.通過在mdx小鼠上對其他三類不同寡核苷酸藥物的測試,證明GF可適用于其他類寡核苷酸藥物,具有普適性。6.通過對GF在不同疾病模型上的系統(tǒng)測試,證明GF可促進(jìn)反義寡核苷酸藥物在其他能量缺乏疾病模型的系統(tǒng)攝取和活性,可適用于其他能量缺陷型疾病模型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R965

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本文編號：2313752