【摘要】：目的:杜興肌肉萎縮癥是一種致死性的伴X染色體遺傳的神經肌肉疾病,是由dystrophin基因突變導致dystrophin蛋白缺失而引起,目前在臨床上還沒有有效的治療方法。盡管不同的基因治療方法取得不同程度的進展,但都存在一定的局限性。其中,反義寡核苷酸干預前體RNA拼接過程的療法被認為是最有應用前景的療法之一。目前已有兩種不同結構的反義寡核苷酸藥物進入臨床試驗,但二者都存在系統(tǒng)運輸效率低、用藥量大以及在心臟中作用效果有限的問題。因此,亟需研發(fā)新型運輸輔助劑來提高反義寡核苷酸藥物的系統(tǒng)運輸效率,從而增強藥效及減少用藥量。5%葡萄糖已在臨床上被長期廣泛使用,本課題組在研究中,發(fā)現葡萄糖及其他碳水化合物均能提高反義寡核苷酸PMO的活性�；谶@一發(fā)現,本課題對碳水化合物對反義寡核苷酸藥物活性的影響展開系統(tǒng)研究,并深入地闡釋碳水化合物的作用機理。方法:1.碳水化合物與PMO在mdx小鼠上的局部和系統(tǒng)測試:首先將不同碳水化合物分別與PMO混合,在杜興肌肉萎縮癥疾病模型-mdx小鼠上,經局部和系統(tǒng)測試,利用IHC、RT-PCR及Western blot方法,以確定最佳候選輔助劑;通過在mdx小鼠上系統(tǒng)測試glucose/fructose(GF)與低于系統(tǒng)有效劑量的PMO的作用效果,以確定GF對是否能降低PMO系統(tǒng)有效劑量;按50mg/kg劑量,對PMO-GF在mdx小鼠上進行長期系統(tǒng)測試,分別從dystrophin蛋白表達水平、mdx小鼠肌肉的病理狀態(tài)及肌肉功能恢復和安全性等方面進行系統(tǒng)評估。2.對GF作用機理的闡釋:為確定GF是否通過增強PMO跳讀頻率或細胞攝取而起作用,將PMO和GF分別注射于mdx小鼠同一個前脛骨肌,時間間隔16h;另外,將GF與Lissamine標記的PMO在mdx小鼠上進行系統(tǒng)注射,利用小動物活體成像系統(tǒng)檢測不同組織中熒光強度,以確定GF的作用方式;通過利用GF不同光學異構體、不同濃度GF以及葡萄糖轉運受體抑制劑phloretin,以確定GF跨膜運輸對其功能性的影響;同樣,使用GF類似物2-DG和敲減PFK表達水平等方法,以確認GF代謝對其功能性的影響;利用ATP合成酶抑制劑oligomycin A、ATP注射和系統(tǒng)尾靜脈注射GF并局部注射PMO等試驗,以確認能量與GF功能性的關系;并利用細胞模型,對PMO在細胞上的攝取途徑及GF作用機理進行了確認;在C57BL6和SOD1G93A兩種小鼠模型對GF展開系統(tǒng)測試,以確定GF是否適用于其他能量缺乏小鼠模型。3.GF對其他核酸類藥物的作用效果:分別將GF與肽修飾PMO、2’OMe和GAPDH si RNA在mdx小鼠上進行系統(tǒng)測試,利用IHC、RT-PCR、Western blot和小動物活體成像等方法確認GF對其他核酸類藥物的作用效果。結果:1.碳水化合物與PMO在mdx小鼠上的局部和系統(tǒng)測試結果。對PMO與不同碳水化合物在mdx小鼠上局部和系統(tǒng)篩選結果:發(fā)現GF對PMO活性增強效果最佳。GF與50mg/kg PMO在mdx小鼠上的短期和長期系統(tǒng)測試結果,發(fā)現GF能夠顯著降低PMO系統(tǒng)有效劑量;長期使用GF能夠顯著提高PMO活性和dystrophin蛋白表達水平,改善mdx小鼠肌肉病理狀態(tài)和肌肉功能,且未檢測到任何毒副作用。2.對GF作用機理的闡釋結果。PMO跳讀頻率和體內分布試驗結果表明:GF增加PMO在mdx小鼠肌肉中的細胞攝取率,而對PMO跳讀頻率無影響。L型GF和葡糖糖轉運受體抑制劑phloretin顯著降低PMO活性;而GF濃度超過5%后,其增強PMO活性和dystophin蛋白表達水平達到飽和,表明跨膜運輸影響GF功能性。GF類似物2-DG不能提高PMO的活性;敲低GF代謝過程中關鍵酶PFK表達,GF功效顯著減弱,表明GF分解代謝影響其功能性。ATP合成酶抑制劑oligomycin A能夠顯著抑制GF的功能性;同時,GF和ATP共注射,對PMO活性無明顯的協(xié)同效應,說明GF是通過代謝產能而產生功效;尾靜脈系統(tǒng)注射高劑量GF,可顯著提高局部注射PMO的活性;PMO-GF長期治療的mdx小鼠肌肉中能量狀態(tài)得到明顯改善,這些結果說明GF是通過代謝產能,進而改善細胞中能量狀態(tài)而發(fā)揮功效。在細胞模型上進一步確認,PMO是通過受體介導的內吞作用方式進入細胞,GF代謝產能可提高PMO的細胞攝取;在其他模型上的系統(tǒng)測試結果表明:GF適用于其他能量缺乏的疾病模型。3.GF與其他核酸類藥物在mdx小鼠系統(tǒng)測試結果顯示:GF可顯著提高2’OMe、si RNA和R-PMO在骨骼肌中的攝取和活性。結論:1.本研究首次證明碳水化合物可作為核酸類藥物的運輸輔助劑。2.通過對不同碳水化合物局部及系統(tǒng)篩選測試,確定GF對PMO作用效果最佳,并能顯著降低PMO系統(tǒng)有效劑量。3.通過在mdx小鼠上對PMO-GF長期系統(tǒng)測試,證明GF是一種安全、高效的運輸輔助劑,且長期使用作用效果更為顯著。4.通過系統(tǒng)的體內和體外機理試驗,證明GF是通過分解代謝產能,改善mdx小鼠肌肉中的能量狀態(tài),從而提高肌肉中PMO攝取率和活性。5.通過在mdx小鼠上對其他三類不同寡核苷酸藥物的測試,證明GF可適用于其他類寡核苷酸藥物,具有普適性。6.通過對GF在不同疾病模型上的系統(tǒng)測試,證明GF可促進反義寡核苷酸藥物在其他能量缺乏疾病模型的系統(tǒng)攝取和活性,可適用于其他能量缺陷型疾病模型。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R965

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本文編號：2313751