發(fā)布時間：2018-06-17 14:06

  本文選題：鎘 + 腎小管上皮細胞�。� 參考：《山東農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：鎘是環(huán)境中一種常見的重金屬污染物,對機體的損傷呈多系統(tǒng)性和多器官性。腎臟是鎘毒性損傷的重要靶器官,而腎小管是鎘腎毒性損傷的靶部位。前期研究表明,氧化應激所介導的細胞凋亡在鎘染毒所致原代大鼠腎小管上皮細胞毒性損傷中發(fā)揮主導作用,且該過程中伴隨著胞漿鈣超載。鈣離子(Ca2+)作為一種重要的胞內(nèi)第二信使,對細胞凋亡和細胞自噬具有重要的調(diào)控作用。然而,鎘暴露所致胞漿鈣超載的來源、Ca2+對鎘所誘導腎小管上皮細胞凋亡及細胞自噬的調(diào)控作用尚未見報道。鑒于此,本論文重點研究胞內(nèi)鈣重分布在鎘所誘導大鼠腎小管上皮細胞凋亡與自噬中的作用,為鎘的腎毒性機制研究提供重要的理論依據(jù)。首先,對鎘誘導胞漿鈣超載的來源進行了探究。在本實驗中,用胞漿Ca2+特異性探針Fluo-4-AM,線粒體Ca2+特異性探針dihydro-Rhod-2-AM和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+特異性探針Mag-Fluo-4-AM分別檢測胞漿、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+水平。通過rPT細胞在含鈣和無鈣兩種培養(yǎng)體系中進行不同時間的鎘暴露,對胞漿鈣濃度的變化進行檢測。接著檢測了鎘暴露對胞漿、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+水平的影響。隨后鎘與2-APB共孵育12 h,檢測2-APB對鎘誘導的胞內(nèi)鈣重分布的影響。最后采用放射免疫分析法和免疫印跡法分別檢測鎘染毒對IP_3含量和IP_3R(IP_3R-1與IP_3R-2)蛋白表達水平的影響。結果表明鎘暴露導致胞內(nèi)鈣重分布,且IP_3-IP_3R通路激活導致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放是胞漿鈣超載的主要來源。其次,探討了鎘誘導的胞漿鈣超載對細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。用TG、BAPTA-AM及2-APB對細胞進行處理,對胞漿鈣超載與細胞凋亡的關系進行研究。首先通過Hoechst33258染色來觀察細胞核凋亡的形態(tài)變化,同時用細胞流式技術對細胞凋亡率進行檢測,最后通過CCK-8檢測細胞存活率。結果表明鎘誘導的胞漿鈣超載可促進細胞凋亡,導致細胞毒性。再次,對鎘誘導的胞漿鈣超載與細胞自噬的關系展開研究。首先對LC3、p62的蛋白表達水平進行了檢測,接著使用RFP-GFP-LC3與GFP-LC3對細胞進行轉染,觀察鎘誘導的胞漿鈣超載對自噬流以及自噬小體數(shù)量的影響。結果表明在鎘處理的腎小管上皮細胞中,胞漿鈣超載抑制自噬流并且阻礙自噬小體的降解。隨后,采用免疫熒光技術對LC3與LAMP-1及LC3與Rab7的共定位情況進行檢測,結果顯示鎘誘導的胞漿鈣超載可阻礙自噬小體與溶酶體的融合,主要原因是Rab7對自噬小體的載運功能失效。最后,對氧化應激與自噬之間的聯(lián)系展開了研究。首先用三種胞漿鈣調(diào)控劑對胞漿鈣超載與氧化應激之間的聯(lián)系進行了檢測。隨后采用ROS清除劑NAC對細胞進行處理。先對LC3和P62蛋白表達量進行分析。再采用免疫熒光技術對LC3與LAMP1及LC3與Rab7進行共定位分析。結果表明在鎘處理的大鼠腎小管上皮細胞中,胞漿鈣超載促進氧化應激的產(chǎn)生,且氧化應激參與鎘誘導的自噬流損傷。綜上所述,鎘暴露導致胞內(nèi)鈣重分布,即胞漿鈣超載同時伴隨線粒體鈣超載與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣外流;IP_3激活的IP_3R通路導致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放是胞漿鈣超載的主要來源。鎘誘導的胞漿鈣超載在促進細胞凋亡的同時抑制自噬流,提示我們胞漿鈣超載在自噬和凋亡中的起到雙重調(diào)節(jié)作用。升高的胞漿鈣離子主要通過抑制Rab7對自噬小體的載運作用來抑制自噬小體與溶酶體的融合從而導致自噬流抑制,造成自噬小體的蓄積。鎘誘導的胞漿鈣超載可激活氧化應激,且氧化應激可誘導自噬流損傷。
[Abstract]:In this experiment , the effects of cadmium exposure on cell apoptosis and cell autophagy in rat renal tubular epithelial cells induced by cadmium were studied .
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R99

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本文編號：2031317