本文選題：CP-25 + 5-FU��； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)流行性評(píng)估報(bào)告GLOBOCAN 2012(Estimated Cancer Incidence,Mortality and Prevalence Worldwide in 2012)顯示,肝癌發(fā)生率在癌癥中排第六位,死亡率排第二位,且男性發(fā)病率明顯高于女性。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌的最主要類(lèi)型,其具有轉(zhuǎn)移性強(qiáng),惡性程度高,預(yù)后較差等特點(diǎn)。HCC的治療手段較多(包括手術(shù)、放療、化療、肝臟移植等),其中手術(shù)是HCC治療的最重要手段。但由于HCC發(fā)病隱匿,多數(shù)患者被確診時(shí)即為晚期,錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)時(shí)期。化學(xué)治療是當(dāng)前除手術(shù)切除外最主要的HCC治療手段,然而化療藥物選擇性差、易耐藥且毒副作用大的缺點(diǎn),導(dǎo)致其治療效果不如人意。因此,尋求新的安全有效的抗HCC化療藥物顯得尤為重要。CP-25是一種新型活性單體藥物-苯磺酰芍藥苷(芍藥苷-6-氧-苯磺酸酯),是由我們所通過(guò)對(duì)天然藥物白芍中的活性單體芍藥苷(Pаe)進(jìn)行酯化修飾后得到的單體化合物,具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。然而CP-25是否具有抗HCC的作用,尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),CP-25可抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖和肝癌H22細(xì)胞移植瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。由此我們推測(cè),CP-25具有一定的抗HCC作用。但初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,單用CP-25抗HCC作用較弱,可能與臨床使用的化療藥物細(xì)胞毒性作用不同。5-FU是目前臨床最常用的抗消化道腫瘤藥物,單用5-氟尿嘧啶對(duì)HCC有確定的治療作用,但毒副作用較大,常見(jiàn)有胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)以及骨髓抑制等。目前研究發(fā)現(xiàn),部分抗癌藥物進(jìn)行聯(lián)合具有協(xié)同抗癌作用,主要的毒副作用不重疊,所以具有高效和低毒的特點(diǎn)。通過(guò)閱讀文獻(xiàn)和前期實(shí)驗(yàn)推測(cè),我們發(fā)現(xiàn)CP-25和5-FU在部分機(jī)制上有著相似重合的可能性。因此,本課題在以往研究的基礎(chǔ)上,采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,探究CP-25聯(lián)合5-FU抗HCC的作用及其部分可能的作用機(jī)制。目的:探究CP-25聯(lián)合5-FU抗HCC的作用及其部分可能的作用機(jī)制。方法:1將50只兩周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、CP-25組(70 mg·kg-1)、5-FU組(5-FU,20 mg·kg-1)和CP-25+5-FU組(CP-25,70 mg·kg-1;5-FU,20 mg·kg-1),共5組,每組10只。除正常組外,其他各組小鼠一次性腹腔注射DEN溶液20 mg·kg 1,正常組小鼠腹腔注射等體積的溶媒。第16 w開(kāi)始,給藥組按CP-25灌胃(1次/d,6次/w)、5-FU腹腔注射(1次/3d,2次/w)方式給予小鼠體內(nèi),連續(xù)給藥8 w,正常組及模型組給予等量的溶媒。第44 w眼球放血處死小鼠,摘取肝臟、脾臟、肺等臟器,稱量小鼠各臟器重量,計(jì)數(shù)肝臟表面腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和體積;HE染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化;賴氏法檢測(cè)血清中ALT,ALP,AST水平;ELISA法檢測(cè)血清中AFP水平。Western blot、免疫組化法檢測(cè)肝臟中P53,Bax,Bcl-2,Caspase-9,Cytochrome c,MMP-2,MMP-9蛋白表達(dá)水平。2選取肝癌細(xì)胞株HepG2和Bel-7402,分別將CP-25、5-FU、CP-25+5-FU加入HepG2和Bel-7402細(xì)胞培養(yǎng)液中,培養(yǎng)24、48 h。CCK-8檢測(cè)CP-25聯(lián)合5-FU對(duì)HepG2和Bel-7402的生長(zhǎng)抑制作用;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)HepG2和Bel-7402凋亡的影響;劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell等檢測(cè)對(duì)Bel-7402侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。Western-blot法檢測(cè)HepG2和Bel-7402中P53,Bax,Bcl-2,Caspase-9,Cytochrome c以及Bel-7402中MMP-2,MMP-9蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.CP-25聯(lián)合5-FU對(duì)DEN誘導(dǎo)HCC小鼠的治療作用1.1對(duì)DEN誘導(dǎo)的HCC小鼠腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和結(jié)節(jié)體積的影響肝臟圖片顯示,正常組小鼠肝臟表面圓潤(rùn)、光滑、無(wú)結(jié)節(jié)形成;模型組小鼠肝臟表面粗糙、凹凸不平,有明顯的腫瘤結(jié)節(jié)形成。與模型組相比,CP-25組、5-FU組及CP-25+5-FU組均能明顯減少肝臟表面結(jié)節(jié)數(shù)、減小腫瘤結(jié)節(jié)體積;與單獨(dú)用藥組(CP-25組、5-FU組)相比,CP-25+5-FU組肝臟表面結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少。1.2對(duì)DEN誘導(dǎo)的HCC小鼠肝臟指數(shù)、脾指數(shù)的影響SPASS分析結(jié)果表明,模型組小鼠肝臟、脾指數(shù)明顯高于正常組。與模型組相比,CP-25、5-FU及CP-25+5-FU均能顯著降低DEN誘導(dǎo)的HCC小鼠升高的肝臟、脾臟指數(shù)。而CP-25+5-FU組與5-FU組相比,脾臟指數(shù)顯著降低,肝臟指數(shù)無(wú)顯著性差異。1.3 CP-25聯(lián)合5-FU顯著改善DEN誘導(dǎo)的肝組織病理?yè)p傷HE病理圖片顯示,正常組小鼠肝組織細(xì)胞核清晰,肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞索排列整齊;模型組小鼠肝細(xì)胞大小、形態(tài)各異,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,形成大量假小葉和炎性細(xì)胞浸潤(rùn);CP-25組、5-FU組及CP-25+5-FU組均可明顯改善肝臟損傷,減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和假小葉形成;而CP-25+5-FU組與CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組相比,能明顯改善肝臟的病理?yè)p傷。1.4 CP-25聯(lián)合5-FU顯著降低DEN誘導(dǎo)升高的血清AST,ALT,ALP,AFP水平模型組小鼠血清中AST,ALP,ALT,AFP水平均明顯高于正常組。CP-25組、5-FU組及CP-25+5-FU組小鼠血清ALT,AST,ALP,AFP水平均明顯低于模型組。CP-25+5-FU組與CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組相比,小鼠血清ALT,AST,ALP,AFP水平明顯降低。1.5對(duì)DEN誘導(dǎo)HCC小鼠肝組織中P53,Bax,Bcl-2,Cytochrome c,Caspase-9,MMP-2,MMP-9蛋白表達(dá)的影響與正常組相比,模型組小鼠肝組織中P53,Bax,Cytochrome c,Caspase-9表達(dá)明顯降低,Bcl-2,MMP-2,MMP-9表達(dá)顯著升高。CP-25組、5-FU組、CP-25+5-FU組小鼠肝組織中P53,Bax,Cytochrome c,Caspase-9表達(dá)明顯高于模型組,而B(niǎo)cl-2,MMP-2,MMP-9水平明顯低于模型組。CP-25+5-FU組升高P53,Bax,Cytochrome c,Caspase-9表達(dá),降低Bcl-2,MMP-2,MMP-9的作用強(qiáng)于CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組。2 CP-25聯(lián)合5-FU對(duì)HCC細(xì)胞HepG2和Bel-7402的作用2.1對(duì)HepG2和Bel-7402生長(zhǎng)的影響與未加藥組相比,CP-25組、5-FU組及CP-25+5-FU組對(duì)均明顯抑制HepG2和Bel-7402的存活率,且CP-25+5-FU組細(xì)胞存活率低于CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組。2.2對(duì)HepG2和Bel-7402凋亡的影響FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示,與未加藥組相比,CP-25組、5-FU組及CP-25+5-FU組對(duì)均明顯促進(jìn)HepG2和Bel-7402凋亡;CP-25+5-FU組處理HepG2,Bel-7402細(xì)胞48 h后,其凋亡率明顯高于CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組。2.3對(duì)Bel-7402侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響CP-25聯(lián)合5-FU作用Bel-7402細(xì)胞24 h后,與未加藥組相比,CP-25組細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力明顯降低,而5-FU組對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力有抑制作用,但無(wú)顯著性差異;與CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組相比,CP-25+5-FU組可明顯抑制肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的能力。2.4對(duì)HepG2和Bel-7402中P53,Bax,Bcl-2,Caspase-9,Cytochrome c,MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響。Western blot結(jié)果顯示,與未加藥組相比,CP-25組、5-FU組及CP-25+5-FU組細(xì)胞中P53,Bax,Cytochrome c,Caspase-9表達(dá)明顯升高,Bcl-2,MMP-2,MMP-9表達(dá)顯著降低。CP-25+5-FU組細(xì)胞中Bax,活化的P53,Caspase-9和Cyt c表達(dá)明顯高于CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組,Bcl-2,MMP-2,MMP-9表達(dá)顯著低于CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組。結(jié)論:1.CP-25聯(lián)合5-FU可抑制DEN誘導(dǎo)的小鼠HCC的發(fā)生和發(fā)展,具有一定的抗HCC作用。2.CP-25聯(lián)合5-FU可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2,Bel-7402凋亡,抑制Bel-7402的侵襲和轉(zhuǎn)移。3.CP-25聯(lián)合5-FU可通過(guò)激活P53誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2,Bel-7402凋亡。
[Abstract]:鑲濈檶鏄渶甯歌鐨勬伓鎬ц偪鐦や箣涓，

本文編號(hào)：1953865