發(fā)布時間：2018-05-08 05:38

  本文選題：二代抗精神病藥物 + Olan�。� 參考：《重慶大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景:以奧氮平(Olanzapine,Olan)為代表的二代抗精神病藥物(Second-generation antipsychotic drugs,SGAs)長期使用容易導(dǎo)致患者體重增加、肥胖和其他代謝性疾病,如高脂血癥、II型糖尿病。研究發(fā)現(xiàn),SGAs誘發(fā)的脂代謝紊亂治療控制不理想、且缺乏相應(yīng)的預(yù)防措施致使心腦血管并發(fā)癥和早逝風(fēng)險大為增加。此類藥物作用外周組織介導(dǎo)脂代謝紊亂的信號通路研究受到國內(nèi)外同行專家的高度關(guān)注,其研究多集中在細(xì)胞水平(如3T3-L1脂肪細(xì)胞、Hep G2肝癌細(xì)胞、以及一些原代細(xì)胞)。然而,整體水平上進(jìn)行藥物代謝性副作用的觀察,尤其針對特定作用靶點(diǎn)進(jìn)行藥物干預(yù)的研究鮮有報道。倍他司汀(betahistine)是臨床上已有的組胺H1受體(histamine H1 receptor,H1R)激動劑、H3受體(histamine H3 receptor,H3R)拮抗劑。研究發(fā)現(xiàn),倍他司汀直接激活大鼠下丘腦中H1R,降低Olan對該受體的拮抗效應(yīng),從而減少了食物的攝取和體重的異常增加。肥胖往往是血脂紊亂的外在表現(xiàn),那么,對體重有良好控制作用的倍他司汀是否能較好地調(diào)節(jié)Olan引起的脂代謝紊亂呢?而其中的干預(yù)機(jī)制未見報道。肝臟是SGAs引起脂代謝紊亂的主要外周組織,而其中各項(xiàng)脂代謝觀察指標(biāo)處于動態(tài)變化中。為了正確詮釋這些變化的真正意義,本課題欲模擬Olan臨床口服給藥方式和推薦劑量,誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生脂代謝紊亂,在此基礎(chǔ)上,研究該藥物對肝臟中兩個脂肪代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子甾醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins,SREBPs)、過氧化物酶體增殖激活受體(peroxisome proliferator activated receptorsα,PPARα)以及它們下游基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響,進(jìn)一步觀察肝臟上H1R等受體和能量調(diào)節(jié)關(guān)鍵分子AMP依賴蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)因Olan多用后的變化。通過以上研究,探明Olan介導(dǎo)脂代謝紊亂的潛在機(jī)制,同時,評價臨床已有藥物倍他司汀干預(yù)脂代謝紊亂的療效,進(jìn)一步揭示其干預(yù)治療的分子機(jī)制。研究方法:實(shí)驗(yàn)一模擬Olan臨床口服給藥方式和推薦劑量,由多劑量比較實(shí)驗(yàn),誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生脂代謝紊亂,并確定脂代謝紊亂機(jī)制研究中的最佳藥物劑量:選擇體重為180-220 g成年Sprague Dawley(SD)大鼠,通過主動口服方式,分別給予0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/kg體重的Olan(t.i.d.),連續(xù)2周,期間檢測大鼠體重、攝食、飲水變化。藥物處理2周后,檢測血清TG、TC、HDL、LDL以及空腹血糖值。實(shí)驗(yàn)二單劑量口服Olan藥代動力學(xué)研究:為了明確給藥次數(shù)以及動物處理及采樣時間點(diǎn),在實(shí)驗(yàn)一多劑量Olan誘導(dǎo)脂代謝紊亂的比較實(shí)驗(yàn)后,本章節(jié)通過藥代動力學(xué)研究方法,進(jìn)一步明確1 mg/kg Olan口服給藥后,藥物在大鼠體內(nèi)血藥濃度達(dá)峰時間、峰值、藥物消除半衰期。實(shí)驗(yàn)三Olan對SREBP調(diào)控的脂肪代謝相關(guān)基因m RNA表達(dá)的急性影響及不同組織間的差異:為了盡量減少代謝產(chǎn)物(如TG、TC)引起的反饋調(diào)節(jié)效應(yīng)以及肥胖對代謝的影響,在Olan(1 mg/kg)單次口服給藥后6 h,即血藥濃度達(dá)到峰值和12 h,此時血藥濃度已降至峰值的25%時,檢測肝臟及白色脂肪組織中(腎周墊)SREBP調(diào)控的脂肪代謝相關(guān)基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄變化。實(shí)驗(yàn)四基于臨床用藥情況,考察Olan和倍他司汀介入治療對血脂濃度及SREBP-1和PPARα依賴的脂肪代謝調(diào)控通路的影響:1 mg/kg體重的Olan(t.i.d.)長期且反復(fù)處理大鼠,屆時倍他司汀(9.6 mg/kg,t.i.d.)介入治療,考察血液及肝臟中脂質(zhì)濃度的變化;利用熒光定量RT-PCR以及Western blot對SREBP-1和PPARα依賴的脂肪代謝調(diào)控通路中相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)五肝臟組胺H1受體及AMPKα在倍他司汀逆轉(zhuǎn)Olan引起的血脂異常中的作用探索:基于中樞神經(jīng)中的變化,利用熒光定量RT-PCR以及Western blot檢測肝臟上組胺H1受體和AMPKα表達(dá)量及后者磷酸化水平。研究結(jié)果:①模擬Olan臨床口服給藥方式,成功誘導(dǎo)了大鼠脂代謝紊亂。結(jié)果顯示,1.0及2.0 mg/kg劑量組的大鼠,體重、白色脂肪總量、TG、TC的濃度均顯著高于對照組,而低劑量組與對照組無顯著性差異。4.0 mgk/kg最高劑量組的大鼠,食物攝入量、血清中TC濃度以及空腹血糖濃度與對照組相比均有顯著性增加,尤其空腹血糖濃度在所有劑量組中升幅最大,但這一組動物體重、白色脂肪總量以及TG的增加并不顯著。在參考以往脂代謝紊亂大鼠模型指標(biāo)的基礎(chǔ)上,我們認(rèn)為1.0及2.0mg/kg兩個濃度的Olan經(jīng)口服給藥能引起大鼠顯著的脂代謝紊亂,并且這兩個藥物濃度及其口服給藥方式可以作為之后研究Olan脂代謝紊亂機(jī)制時的動物模型構(gòu)建方法。②通過大鼠單劑量口服Olan的藥代動力學(xué),發(fā)現(xiàn)大鼠服藥后6 h,血藥濃度達(dá)到最大值——276.5 ng/m L,藥物消除半衰期為3.5 h,由此確定了1 mg/kg Olan長期作用時,一天三次的給藥次數(shù)以及藥物急性效應(yīng)研究中6 h和12 h的兩個采樣時間點(diǎn)。③Olan急性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在白色脂肪組織和肝臟中,Olan對SREBPs及其調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)有著直接的激活作用。藥物處理后6 h,srebp-1c和下游靶基因acc1、fasn,以及srebp-2和它調(diào)控的hmgcs、hmgcr、ldlr基因表達(dá)均顯著增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中,單劑量口服Olan處理動物6 h和12 h,未能引起血清中TC,TG,HDL-C,LDL-C濃度的顯著變化,因此,我們認(rèn)為藥物處理后各時間點(diǎn)所有基因表達(dá)的變化均是藥物直接效應(yīng)而非產(chǎn)物引起的負(fù)反饋調(diào)節(jié)結(jié)果。此外,Olan對脂肪酸和膽固醇合成基因的刺激作用表現(xiàn)出不同的變化模式。SREBP-2控制的膽固醇合成基因在血藥濃度達(dá)到峰值時其表達(dá)被顯著增強(qiáng);當(dāng)血藥濃度下降后,最初上調(diào)的表達(dá)顯著回落至基點(diǎn)。相反,SREBP-1及其調(diào)控的脂肪酸合成基因(fasn、acc1)卻因?yàn)樗幬锏淖饔?m RNA的表達(dá)持續(xù)升高,即使在血藥濃度降低后(12 h)。④Olan長期作用引起了大鼠體重和血清NEFA(游離脂肪酸,non-esterified fatty acid)、TG以及肝臟組織中油脂的顯著增加,卻沒有引起TC的明顯改變。倍他司汀介入有效地改善了Olan引起的血脂紊亂。分子檢測發(fā)現(xiàn),單獨(dú)Olan處理導(dǎo)致了Srebp-1及其下游的脂肪酸合成關(guān)鍵基因(Acc1,Fasn,Scd1)轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(p0.01)。其中,Scd-1基因表達(dá)增加到5.18±0.56倍(p0.01)。與Olan實(shí)驗(yàn)組相比,聯(lián)合給藥組中這些基因的表達(dá)被顯著抑制。蛋白檢測發(fā)現(xiàn),雖然胞漿中SREBP-1前體蛋白(precursor form SREBP-1,p-SREBP-1)濃度并無顯著變化,但核內(nèi)活性形式的SREBP-1含量則因Olan的作用顯著增加(p0.05)。Olan也因此增加了SREBP-1蛋白的活化率(the ratio of m-SREBP-1 over p-SREBP-1 protein levels)。重要的是,單獨(dú)使用倍他司汀以及聯(lián)合給藥組的動物,肝臟中m-SREBP-1濃度較Olan組均出現(xiàn)了顯著地下降(p0.05),并且血清TG濃度與核內(nèi)m-SREBP-1蛋白含量呈顯著的正相關(guān)(r=0.459,p=0.012)。此外,Olan長期作用后顯著地降低了CPT1A蛋白含量(p0.05),而單獨(dú)使用倍他司汀以及聯(lián)合給藥組的動物,肝臟中PPARα的轉(zhuǎn)錄水平(p0.01)和蛋白水平(p0.05)均被顯著增加。而且,肝臟中TG的含量與PPARα蛋白濃度表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.316,p=0.039)。而它下游的靶分子CPT1A,在倍他司汀和聯(lián)合藥物作用和都表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄水平的增加(p0.05)。⑤Olan長期作用使肝臟上H1R受體濃度顯著增加了~67%,這種變化趨勢與核內(nèi)m-SREBP-1蛋白的濃度呈顯著正相關(guān)(r=0.343,p=0.05)。在倍他司汀聯(lián)合給藥組中,H1R受體的濃度下降到對照組的~76%(p0.01)。其中,H1R受體濃度與血漿中NEFA濃度表現(xiàn)出非常顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.502,p=0.005),與肝臟中AMPKα的磷酸化水平也存在著非常顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.772,p0.001)。但是其余三個受體除M3R的濃度因Olan作用有顯著增加外(p0.05),其余各受體并未因藥物作用出現(xiàn)顯著性變化。對于肝臟AMPKα的檢測,Olan并未引起該分子及其磷酸化水平的顯著性變化,但倍他司汀卻引起了磷酸化AMPKα(p AMPKα)分子表達(dá)的顯著增強(qiáng),且p AMPKα/AMPKα值也顯著增加(p0.05)。AMPKα下游分子ACC1,其磷酸化蛋白濃度因倍他司汀單獨(dú)以及聯(lián)合處理分別比對照組增加了~54%和~47%的濃度(p0.05)。ACC1因倍他司汀作用減少至對照組的~63%(p0.05),與之相反的是,Olan作用則促了ACC1分子表達(dá)(p0.01)。整個過程中,ACC1蛋白濃度與m-SREBP-1分子濃度有著顯著地正相關(guān)性(r=0.603,p=0.004),而與p AMPKα濃度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.387,p=0.009)。此外,分析p AMPKα?xí)r發(fā)現(xiàn),該分子表達(dá)水平與CPT1A蛋白濃度有著非常顯著的正相關(guān)性(r=0.849,p0.001)。結(jié)論:本課題模擬Olan臨床口服給藥方式和推薦劑量(1 mg/kg),成功誘導(dǎo)了大鼠脂代謝紊亂,并在此基礎(chǔ)上,初步探明了Olan引起脂代謝紊亂的藥理機(jī)制:①Olan直接作用肝臟和脂肪組織中SREBP調(diào)控的脂肪代謝通路,并增強(qiáng)p-SREBP-1的翻譯后剪切激活作用,促進(jìn)脂肪合成基因表達(dá);②Olan下調(diào)CPT1A基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),使脂肪合成增加,分解下降,最終導(dǎo)致血脂升高。鑒于脂代謝紊亂的嚴(yán)重性,基于外周組織脂代謝紊亂調(diào)控機(jī)制,首次采用臨床已有組胺H1受體激動劑——倍他司汀,成功逆轉(zhuǎn)Olan誘發(fā)的脂代謝紊亂,并初步探明了該藥物干預(yù)脂代謝紊亂的可能機(jī)制:①首先,倍他司汀結(jié)合H1R,激活A(yù)MPKα,抑制p-SREBP-1的翻譯后加工剪切;②被激活的AMPKα直接磷酸化下游靶分子ACC1,這一效應(yīng)可能導(dǎo)致產(chǎn)物丙二醇輔酶A合成降低,從而減除了對CPT1A分子的抑制作用;③促進(jìn)PPARα和下游CPT1A的表達(dá),增加脂肪分解。綜上所述,本研究結(jié)果區(qū)分于以往細(xì)胞水平上或是非臨床給藥方式和劑量的動物模型研究,從模擬臨床用藥的整體水平上揭示了Olan引起脂代謝紊亂的分子藥理機(jī)制。而倍他司汀的干預(yù)也呈現(xiàn)多點(diǎn)性特點(diǎn):經(jīng)肝臟上組胺H1受體,影響AMPKα、SREBP-1、PPARα等多個通路以改善血脂異常。該研究為臨床上SGAs介導(dǎo)脂代謝紊亂的診斷性生物標(biāo)志物的篩選以及干預(yù)性治療提供了實(shí)驗(yàn)資料和新的研究策略。
[Abstract]:Background : The long - term use of the second - generation antipsychotic drugs ( SGAs ) , represented by Olanzapine ( Olanzapine , Olan ) , is easy to cause weight gain , obesity and other metabolic disorders such as hyperlipidemia , type II diabetes . The study found that SGAs - induced lipid metabolism disorders are not ideal , and the lack of corresponding preventive measures has resulted in a significant increase in cardiovascular and cerebrovascular complications and early death risks . In order to properly explain the effect of Olan on lipid metabolism disorder , it was found that the mechanism of Olan - mediated lipid metabolism disturbance was reduced . In order to minimize the effects of serum TG , TC , HDL , LDL and fasting plasma glucose levels in rats after 2 weeks of oral administration of Olan ( 1 mg / kg ) , the effects of serum TG , TC , HDL , LDL and fasting plasma glucose levels were studied . In this experiment , we found that Olan treated animals 6 h and 12 h after oral administration could induce a significant increase in lipid metabolism in rats . The results showed that the expression of serum TC , TG , HDL - C and LDL - C in rats were significantly increased after the drug treatment . In comparison with Olan experimental group , the expression of scd - 1 gene was increased to 5.18 鹵 0.56 times ( p0.01 ) . The expression of scd - 1 gene was increased to 5.18 鹵 0.56 times ( p0.01 ) . Importantly , the concentrations in the liver and in the Olan group were significantly lower than that in Olan group ( p < 0.05 ) , and the serum TG concentration was positively correlated with the protein content in the core ( r = 0.459 , p = 0.012 ) . In addition , the content of CPT1A protein ( p0.01 ) and protein level ( p . 05 ) were significantly decreased after Olan ' s long - term effect , while the levels of PPAR偽 in liver ( p0.01 ) and protein level ( p0.05 ) were significantly increased ( r = - 0.316 , p = 0.039 ) . The concentration of H1R receptor in liver was significantly increased by ~ 67 % ( r = 0.343 , p = 0.05 ) . There was a significant negative correlation between the concentration of H1R receptor and NEFA in plasma ( r = - 0.502 , p = 0.005 ) , and there was a significant negative correlation with the phosphorylation level of AMPK 偽 in the liver ( r = - 0.772 , p0.001 ) . Compared with the control group , the concentration of ACC1 was significantly higher than that in the control group ( p < 0.05 ) . In addition , it was found that the expression level of pAMPK 偽 was positively correlated with CPT1A protein concentration ( r = 0.849 , p0.001 ) . Conclusion : In this study , we studied the mechanism of lipid metabolism disorder induced by Olan : 鈶，

本文編號：1860167