本文選題：脂肪細胞 + 自噬��； 參考：《上海交通大學》2015年博士論文

【摘要】：第一部分脂肪細胞應(yīng)激誘導自噬的作用及機制研究目的:探討高脂環(huán)境下自噬活性的變化及其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。方法:通過Western blot、免疫熒光、電鏡三種方法檢測棕櫚酸負荷下分化成熟脂肪細胞自噬活性的變化;RT-PCR和Western blot方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路,觀察自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的先后順序,并通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路觀察自噬水平的變化,明確自噬的誘導機制;通過藥物性抑制自噬,分別用Western blot方法檢測對細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號及MTT法檢測對細胞存活率的影響。結(jié)果:棕櫚酸顯著誘導分化成熟的脂肪細胞自噬活性的增加,表現(xiàn)為自噬體和自噬溶酶體形成增多,自噬特異性蛋白LC3-II的積累量增多及自噬流的增加;棕櫚酸誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生且先于自噬的激活,并且抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導致LC3-II的積累量降低;此外,抑制自噬增加了細胞對應(yīng)激和凋亡的敏感性。結(jié)論:棕櫚酸激活成熟分化脂肪細胞的自噬活性增加;自噬的激活部分依賴棕櫚酸誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑;自噬作為適應(yīng)性反應(yīng)在應(yīng)激環(huán)境下增加細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細胞調(diào)亡的抵抗。第二部分自噬對脂肪細胞的炎癥因子的調(diào)節(jié)作用目的:探討自噬激活對脂肪細胞炎癥因子的調(diào)節(jié)作用方法:通過免疫組化和RT-PCR方法,觀察飲食誘導肥胖鼠脂肪組織及高脂誘導脂肪細胞的炎癥表現(xiàn)以及自噬相關(guān)基因的表達,明確炎癥和自噬的水平;分別通過藥物性抑制和si RNA干擾自噬基因的方法阻斷自噬,RT-PCR方法檢測炎癥因子MCP-1和IL-6的表達水平,明確自噬對炎癥因子的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果:飲食誘導肥胖鼠脂肪組織切片的HE染色和CD68免疫組化分析結(jié)果表現(xiàn)為炎癥細胞的浸潤增加,RT-PCR方法檢測棕櫚酸誘導分化脂肪細胞炎癥因子的表達水平上調(diào)。肥胖誘導的脂肪組織及棕櫚酸誘導脂肪細胞都表現(xiàn)為自噬基因的表達升高。3-MA自噬特異性抑制和si RNA轉(zhuǎn)染自噬相關(guān)基因Becn1干擾自噬的形成,RT-PCR法檢測MCP-1和IL-6的表達水平上調(diào)。結(jié)論:在肥胖誘導的脂肪組織和單獨脂肪細胞的炎癥反應(yīng)中自噬被激活,自噬作為應(yīng)激環(huán)境下的適應(yīng)性機制參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié),并發(fā)揮抗炎的作用。第三部分雷帕霉素的抗應(yīng)激和抗炎作用及其與自噬活性的關(guān)系目的:探討雷帕霉素的抗應(yīng)激和抗炎作用及其與自噬活性的關(guān)系方法:Western blot方法檢測m TORC1信號下游磷酸化S6K1蛋白表達,觀察棕櫚酸對m TORC1信號的影響,同時驗證雷帕霉素對脂肪細胞m TORC1信號的抑制作用。分別用雷帕霉素預(yù)處理脂肪細胞,通過Western blot和RT-PCR方法檢測雷帕霉素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號蛋白和炎癥因子及炎癥通路NF-κB表達的影響;并通過藥物性抑制和si RNA干擾自噬的方法進一步明確,雷帕霉素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用與自噬的關(guān)系。結(jié)果:棕櫚酸顯著誘導脂肪細胞磷酸化S6K1蛋白表達增加,且可被雷帕霉素所抑制;雷帕霉素顯著下調(diào)棕櫚酸誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號蛋白的表達,但CQ抑制自噬消除了雷帕霉素的抗應(yīng)激作用;雷帕霉素顯著抑制NF-κB炎癥信號及其介導的炎癥因子MCP-1和IL-6的表達,si Becn1干擾自噬可部分阻斷雷帕霉素的抗炎作用。結(jié)論:棕櫚酸誘導m TORC1信號上調(diào)促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生,雷帕霉素發(fā)揮抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和抗炎的作用,且雷帕霉素的這些有益作用部分依賴自噬途徑的激活。
[Abstract]:The first part of the study on the role and mechanism of autophagy induced by adipocyte stress: To explore the changes of autophagic activity and the relationship with endoplasmic reticulum stress in high fat environment. Methods: the changes of autophagic activity of mature fat cells under palmitic acid load were detected by three methods of Western blot, immunofluorescence and electron microscopy; RT-PCR and Western blot Methods to detect the endoplasmic reticulum stress signal pathway, observe the sequence of autophagy and endoplasmic reticulum stress, and to observe the changes of autophagy by inhibiting the endoplasmic reticulum stress signal pathway and clear the induction mechanism of autophagy. Through the drug inhibition of autophagy, the Western blot method was used to detect the endoplasmic reticulum stress signal and the MTT method, respectively. Results: palmitic acid significantly induced an increase in autophagic activity of mature adipocytes, showing an increase in the formation of autophagosomes and autophagosomes, increased accumulation of autophagic specific protein LC3-II and increased autophagic flow; palmitic acid induced endoplasmic reticulum activation and inhibition of autophagic activation, and inhibition of endoplasmic reticulum. In addition, inhibition of autophagy increases the sensitivity of LC3-II to stress and apoptosis. Conclusion: palmitic acid activates the autophagic activity of mature and differentiated adipocytes, the activation of autophagy is partly dependent on the endoplasmic reticulum stress pathway induced by palmitic acid; autophagy increases in the stress environment as an adaptive response. The resistance of cell to endoplasmic reticulum stress and cell apoptosis. Second the regulation of autophagy to the inflammatory factors of adipocytes: Objective To investigate the regulation of autophagy activation on adipocyte inflammatory factors: the inflammatory expression of fat and high fat induced adipose cells in obese rats was observed by immunohistochemical and RT-PCR methods. And the expression of autophagy related genes, clear the level of inflammation and autophagy; blocking autophagy by drug inhibition and Si RNA interfering autophagy genes, RT-PCR methods to detect the expression level of inflammatory factors MCP-1 and IL-6, and the regulation of autophagy to inflammatory factors. Fruit: HE staining in fat tissue slices of obese rats induced by diet The results of CD68 immunohistochemical analysis showed that the infiltration of inflammatory cells increased, and the expression of palmitic acid induced the expression level of inflammatory factors in differentiated adipocytes was up-regulated by RT-PCR method. Adipose tissue and palmitic acid induced adipocytes were expressed as autophagic gene expression increased by.3-MA autophagy specific inhibition and Si RNA transfected autophagy The autophagy Becn1 interferes with the formation of autophagy, and the expression level of MCP-1 and IL-6 is up regulated by the RT-PCR method. Conclusion: autophagy is activated in the inflammatory response of fat induced adipose tissue and individual adipocytes. Autophagy participates in the regulation of inflammatory response as an adaptive mechanism under stress environment and plays an anti-inflammatory effect. Third part rapamycin The anti stress and anti-inflammatory effects and its relationship with autophagy: To explore the anti stress and anti-inflammatory effects of rapamycin and its relationship with autophagy: Western blot method was used to detect the expression of S6K1 protein in the downstream of M TORC1 signal, and to observe the effect of palmitic acid on M TORC1 signal, and to verify that rapamycin on M TO in adipocytes. The inhibitory effects of RC1 signal were pretreated with rapamycin. The effects of rapamycin on endoplasmic reticulum stress signal protein and inflammatory factors and the expression of NF- kappa B in endoplasmic reticulum were detected by rapamycin and Western blot and RT-PCR, and the methods of drug inhibition and Si RNA to interfere with autophagy were further clarified. Rapamycin should be used for endoplasmic reticulum. Results: palmitic acid significantly induced the increased expression of phosphorylated S6K1 protein in adipocytes and inhibited by rapamycin, and rapamycin significantly downregulated the expression of endoplasmic reticulum stress signal protein induced by palmitic acid, but CQ inhibited autophagy to eliminate the anti stress effect of rapamycin; rapamycin Significant inhibition of NF- kappa B inflammatory signal and its mediated expression of inflammatory factors MCP-1 and IL-6, Si Becn1 interference with autophagy can partially block the anti-inflammatory effects of rapamycin. Conclusion: the up-regulated m TORC1 signal induced by palmitic acid promotes the occurrence of inflammatory response, rapamycin plays the role of anti endoplasmic reticulum stress and anti-inflammatory, and the beneficial effects of rapamycin The activation of autophagy is partly dependent on the autophagy pathway.

【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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本文編號：1860314