本文選題：細胞凋亡 + cFLIP��； 參考：《昆明理工大學》2017年碩士論文

【摘要】：只有細胞的擴增、分裂和死亡能夠相互協(xié)調(diào),才能維持正常組織的生長平衡。如果凋亡受到抑制,這種平衡就會被打破,細胞病死率也會降低;如果機體不能重新恢復調(diào)節(jié),就會表現(xiàn)出無限增殖,最終形成腫瘤。然而惡性腫瘤又是全球死亡率最高的疾病,所以尋找癌癥的有效治療方法和特效藥是目前急需解決的難題。當前,人們特別注重與腫瘤死亡相關(guān)的一個配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL),它是參與腫瘤壞死的一個控制因子,因為它具有強大特異性的誘導腫瘤細胞凋亡的能力而正常細胞對TRAIL誘導的凋亡耐受;因此,TRAIL是一個很理想的候選靶點對于癌癥的治療。然而,TRAIL是生物蛋白大分子,在生產(chǎn)及運輸中需要消耗大量的成本,因此如果能尋找到TRAIL的類似物是非常有必要的。云南是天然藥物資源的儲庫,如果我們從這個儲庫中尋找到TRAIL的類似活性物,將會大大降低成本,造福于癌癥患者。但是如何從這樣豐富的資源庫中尋找到合適的替代物,一直是我們需要克服的難點。REFI熒光成像是由Canon創(chuàng)造的并且為我們的困難提供了新的思路,我們可以在募集蛋白上融合一個熒光蛋白GFP,然后構(gòu)建一個能夠讓融合蛋白穩(wěn)定表達的單克隆細胞系,最后用此細胞系篩選具有TRAIL類似功能的天然產(chǎn)物。通過細胞凋亡通路的相關(guān)特點,我們實驗室成功構(gòu)建了 PCMV6—cFLIPsK192,195L,△203-221-GFP載體,并將其轉(zhuǎn)染到U20S細胞中得到了穩(wěn)定表達PCMV6—cFLIPsK192,195L,△203-221_GFP的單克隆細胞系;但是用TRAIL處理該細胞系時,發(fā)現(xiàn)與陰性對照組的結(jié)果一樣。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn),A56位能夠使cFLIPs與IKKγ蛋白聚集。因此將A56位突變掉,繼續(xù)將此載體轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中,得到一種入核和一種不入核的細胞系,結(jié)果TRAIL治療后并沒有我想看的熒光。我們分析c-FLIPs之所以能與FADD連接,是因為它有DED,然而細胞中含有大量類似c-FLIPs DED家族蛋白如Procaspase-8、cFLIPL、cFLIPs等,所以外源轉(zhuǎn)入的c-FLIPs-GFP不能被募集。因此我們選擇第三代基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9,在cFLIPs的第五個外顯子及cFLIP的第八個外顯子中敲入GFP,使內(nèi)源性的c-FLIP融合表達GFP。實驗內(nèi)容與結(jié)果:1.針對c-FLIPs的第五個外顯子,成功構(gòu)建了 Guide-RNA、DonorDNA。通過電轉(zhuǎn)技術(shù)將它們共轉(zhuǎn)到HEK293細胞中,發(fā)現(xiàn)有10%的細胞帶有綠色熒光,但是在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)帶有綠色熒光的細胞并不發(fā)生增殖。有關(guān)文獻報道:c-FLIPs的K192和195L位會被泛素化,及它特有的c端尾巴結(jié)構(gòu)會促進c-FLIPs降解。而c-FLIPL不會發(fā)生此種現(xiàn)象,進而選擇c-FLIPL的第八個外顯子作為敲入GFP的靶標。2.針對c-FLIPL的第八個外顯子,成功構(gòu)建了 Guide-RNA、c-FLIPL(8)-GFP片段。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將它們共同轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中,篩選出了帶有綠色熒光的單克隆細胞系,結(jié)果用TRAIL處理該后并沒有看到我們所期望的結(jié)果。3.細胞中含有大量類似c-FLIPsDED家族蛋白如Procaspase-8,因此以目前構(gòu)建好的單克隆細胞為基礎(chǔ)將內(nèi)源性的Procaspase-8敲除掉,再加TRAIL觀察是否有綠色熒光發(fā)生凝聚。目前所構(gòu)建的單克隆細胞系還不能用于后續(xù)的篩藥工程,還需要我們進一步優(yōu)化。
[Abstract]:Human TRAIL is an ideal candidate target for the treatment of cancer . However , it is an ideal candidate target for cancer treatment . We successfully constructed Guide - RNA , c - FLIPL ( 8 ) - GFP fragment . The monoclonal cell line with green fluorescence was screened by transfection with liposome . The results showed that there was a large amount of similar c - FLIPsDED family protein in the cells , such as Procter - 8 .

【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R91

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;The IAP family: endogenous caspase inhibitors with multiple biological activities[J];Cell Research;2000年03期

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本文編號：1860148