本文選題：exosomes　切入點：基因載體　出處：《東南大學》2017年博士論文

【摘要】：隨著分子生物學以及基因組學研究的深入,越來越多疾病的發(fā)生被發(fā)現(xiàn)與基因異常密切相關(guān),或者其發(fā)生過程伴有基因表達異常現(xiàn)象,因此探討如何從基因?qū)用嬷委熂膊∫呀?jīng)成為研究熱點。尤其是最近十多年來包括微小RNA(microRNAs)、siRNA(Small interfering RNA)以及長鏈非編碼 RNA(long noncodingRNA,lncRNA)的發(fā)現(xiàn),更是加速了基因治療的發(fā)展。由于基因治療所要遞送的DNA、RNA或類寡核苷酸分子在體內(nèi)極不穩(wěn)定,很容易在未到達病變細胞之前被核酸酶破壞或降解,很難到達靶組織和細胞發(fā)揮作用,因此高效、安全的基因遞送載體成為了基因治療的關(guān)鍵因素。目前常用的基因載體主要包括病毒載體和非病毒載體兩大類,病毒類載體的優(yōu)勢是具有較好的基因轉(zhuǎn)染能力,缺點是其毒性、免疫源性、致癌作用和難以大規(guī)模生產(chǎn)等問題難以克服;而非病毒載體同樣存在免疫原性的問題。因此構(gòu)建具有體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率高、特異靶向性強和生物安全性好的基因載體顯得十分迫切。外泌體(exosomes)是一種由細胞向外分泌的膜性囊泡,其中含有包括核酸、蛋白因子在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì),目前已經(jīng)證實exosomes能夠?qū)⑦@些來源于親代細胞中的生物學活性物質(zhì)轉(zhuǎn)導至受體細胞,影響受體細胞的生物學行為,扮演著細胞間信號傳導載體的角色。這其中最引人注目的就是exosomes中含有豐富的miRNA,這些miRNA借助exosomes從供體細胞進入受體細胞,通過調(diào)控受體細胞中靶基因的表達,影響受體細胞的生物學行為。在生物體內(nèi)exosomes是一種天然的核酸和細胞因子的載體,受此啟發(fā),近年來,陸續(xù)有研究者開展exosomes作為外源藥物載體的研究。本論文圍繞這一領(lǐng)域,針對exosomes共載化療藥物和基因藥物用于腫瘤的協(xié)同治療、exosomes如何高效的載入外源基因藥物等方面展開研究,取得如下創(chuàng)新性研究成果:1、開展了 exosomes同時作為基因藥物和化療藥物共載體治療腫瘤的研究。我們首先通過基因重組技術(shù)構(gòu)建了能夠展示于exosomes表面、同時具有靶向Her2作用的融合蛋白(tar-Her2)表達質(zhì)粒,之后通過HEK293T細胞過表達該融合蛋白,成功獲得表面含有靶向Her2的重組蛋白的exosomes;隨后,通過電穿孔法成功將miR-21 inhibitor和5-Fu導入exosomes中,實現(xiàn)了 exosomes共載化療藥物和基因藥物。之后,我們開展了 Tar-Her2-EXO/miR-21inhibitor/5-FU的體外和體內(nèi)的抗腫瘤活性和靶向性研究。結(jié)果顯示,Tar-Her2-EXO/miR-21 inhibitor/5-FU在體外及體內(nèi)對Her2高表達的HCT116細胞及其皮下移植瘤均具有較好的靶向作用。同時,我們還發(fā)現(xiàn)Tar-Her2-EXO/miR-21 inhibitor/5-FU在體外和體內(nèi)對腫瘤的抑制作用具有抑制作用,并且顯著強于Tar-Her2-EXO/miR-21 inhibitor或Tar-Her2-EXO/5-FU,表明exosomes作為基因藥物和化療藥物共載體,有利于發(fā)揮兩種藥物的協(xié)同作用,提高腫瘤治療的療效。2、建立了通過生物學方法獲得含有功能性小RNA的exosomes的方法。我們首先構(gòu)建了 miR-21、siR-artificiality以及miR-21 decoy慢病毒表達載體,之后基于HEK293T細胞建立了上述三種功能性小RNA的穩(wěn)定表達細胞株,收集并分析了三種細胞來源的exosomes中相應(yīng)過表達的功能RNA的水平,結(jié)果顯示細胞中過表達的功能性小RNA均能夠進入exosomes中。之后,我們又通過雙熒光素酶報告基因技術(shù)、EGFP報告基因技術(shù)等考察了含有功能小RNA的exosomes對受體細胞中靶基因的影響,結(jié)果顯示這些帶有功能性小RNA的exosomes進入受體細胞后,能夠?qū)κ荏w細胞中靶基因的表達,或相應(yīng)miRNA的功能產(chǎn)生影響。3、探討了通過生物工程方法獲得含有siR-PLK1的exosomes(EXO-siR-PLK1),并在體外探討EXO-siR-PLK1的抗腫瘤作用。我們首先構(gòu)建了能夠表達siR-PLK1和PLK1 silence mutation慢病毒載體,在此基礎(chǔ)上建立了過表達siR-PLK1的細胞株,并獲取了其來源的exosomes(EXO-siR-PLK1)。使用EXO-siR-PLK1處理BT474細胞后,BT474細胞中PLK1的表達被顯著抑制。我們還考察了 EXO-siR-PLK1對BT474細胞周期及增殖的影響,結(jié)果顯示EXO-siR-PLK1能夠破壞BT474細胞的有絲分裂過程,細胞周期被阻滯于G2/M期,同時EXO-siR-PLK1對BT474增殖的抑制作用具有濃度依賴性。綜上所述,本論文的研究豐富了 exosomes作為基因藥物及小分子藥物載體的方法。
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【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R943

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1 朱延亮;Exosomes作為藥物載體的功能化研究[D];東南大學;2017年

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本文編號：1715490