本文選題：樹突狀細(xì)胞　切入點(diǎn)：米非司酮　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：米非司酮是一種人工合成的19-去甲基睪酮衍生物,具有抗孕激素和糖皮質(zhì)激素作用。從首次合成米非司酮以來,米非司酮已被廣泛用作抗早孕治療,并成功用于緊急避孕。多年來的基礎(chǔ)和臨床研究表明,米非司酮在婦產(chǎn)科學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、腫瘤學(xué)及免疫學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域表現(xiàn)出一定的應(yīng)用潛力。米非司酮作為孕激素受體調(diào)節(jié)劑,是目前藥物流產(chǎn)的常規(guī)用藥。近年的研究表明,低劑量的米非司酮具有"內(nèi)膜避孕"作用,然而其作用的免疫學(xué)機(jī)制卻并不清楚。樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DCs)是目前已知的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職性抗原提呈細(xì)胞。吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是細(xì)胞內(nèi)的一種催化色氨酸分子沿犬尿酸途徑進(jìn)行分解代謝的限速酶。IDO主要表達(dá)在樹突狀細(xì)胞,在維持早期妊娠中發(fā)揮重要作用。IDO+tC能夠抑制T細(xì)胞活化與增殖,促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡,誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。因此,在本研究中我們選用外周血樹突狀細(xì)胞為研究對象,就上述疑問探討米非司酮對樹突狀細(xì)胞分化和功能的調(diào)節(jié)及其可能的作用機(jī)制。在本研究結(jié)合體外實(shí)驗(yàn),從細(xì)胞水平,利用Western blot、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、Real-time RT-PCR及流式細(xì)胞檢測等相關(guān)技術(shù),探討米非司酮在胚胎植入過程中對母胎界面獲得性免疫的調(diào)節(jié)及機(jī)理,為新避孕途徑的開發(fā)以及人類的生殖過程中相關(guān)疾病發(fā)生機(jī)理和治療研究提供新的思路。第一部分米非司酮對DCs誘導(dǎo)分化的調(diào)節(jié)作用目的:分選外周血樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs),以 20 nmol/L,65 nmol/L,200 nmol/L米非司酮(Mifepristone,Ru486)分別作用于DCs,觀察米非司酮對DCs成熟及生物學(xué)功能的影響,探討米非司酮在胚胎植入過程中對母胎界面獲得性免疫的調(diào)節(jié)及機(jī)理。方法:人外周血CD14+單核細(xì)胞在體外經(jīng)GM-CSF、IL-4培養(yǎng)6天誘導(dǎo)分化為未成熟DCs。加入不同劑量的米非司酮(20 nmol/L,65 nmol/L,200 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),同時(shí)設(shè)置溶劑對照組(加入米非司酮溶劑dimethyl sulphoxide,DMSO)。流式細(xì)胞儀檢測和分析細(xì)胞表面CD80、CD86和ICAM-I分子的表達(dá)情況。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbnent assay,ELISA)檢測 DCs 培養(yǎng)上清液中IL-12p70水平。結(jié)果:1.米非司酮上調(diào)DCs表面CD80及CD86和ICAM-I分子表達(dá)。2.與對照組相比,米非司酮處理組DCs分泌的IL-12p70水平顯著升高(P0.05)。在一定范圍內(nèi)(65nmol/L～200nmol/L),米非司酮促進(jìn)DCs分泌IL一 12p70的能力隨著米非司酮濃度增大而增強(qiáng)。結(jié)論:1.米非司酮誘導(dǎo)DCs表型成熟,促進(jìn)DCs分泌IL-12。2.在一定濃度范圍內(nèi),米非司酮對DCs的促成熟作用存在量效關(guān)系。3.米非司酮可能通過促進(jìn)DCs成熟,引發(fā)母體對半同種異體胎兒抗原免疫排斥,達(dá)到抗著床避孕。第二部分米非司酮在DCs對獲得性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中的作用目的:通過檢測DCs對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)Foxp3表達(dá)和IL-10分泌的影響,研究米非司酮在DCs對獲得性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中的作用。方法:將不同劑量米非司酮處理后DCs分別與Tregs混合培養(yǎng),蛋白印跡法(Western blot)檢測forkheadboxp3(FOXP3)的表達(dá),ELISA檢測混合培養(yǎng)上清中IL-10的表達(dá)。結(jié)果:未成熟DCs分別經(jīng)20,65,200 nM米非司酮,DMSO溶劑處理后用作刺激細(xì)胞,同種異體Tregs用作反應(yīng)細(xì)胞。采用Western blot檢測FOXP3蛋白水平。我們發(fā)現(xiàn),200nmol/L米非司酮組,FOXP3蛋白表達(dá)較對照組低(0.25±0.03 vs.0.62±0.01;P.01),也較 65nmol/L 米非司酮組低(0.25±0.03 vs.0.34±0.01;P.01)。對照組和20nmol/L米非司酮組間沒有明顯差異。同時(shí),我們采用ELISA檢測上清液中IL-10的表達(dá)。65nmol/L和200nmol/L組IL-10表達(dá)降低,IL-10的變化和FOXP3蛋白水平的變化是一致的。IL-10表達(dá)在對照組,20nmol/L米非酮組,65nmol/L米非司酮組和200nmol/L米非司酮組分別為:171.25±7.85,158.34±9.46,127.36±6.37 和 109.2±9.45。結(jié)論:經(jīng)米非司酮處理后的DCs抑制Tregs表達(dá)FOXP3和IL-10。這提示米非司酮在DCs對獲得性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。第三部分IDO在米非司酮影響DCs功能中的作用目的:1.通過檢測米非司酮對吲哚胺-2,3-雙加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)表達(dá)及其活性的影響。2.探討IDO在米非司酮影響DCs功能中的作用。方法:1.人外周血CD14+單核細(xì)胞在體外經(jīng)GM-CSF、IL-4培養(yǎng)6天誘導(dǎo)分化為未成熟DCs。加入不同劑量的米非司酮(20nmol/L,65nmol/L,200nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),同時(shí)設(shè)置溶劑對照組(加入米非司酮溶劑DMSO)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測IDO mRNA的表達(dá);Western blot檢測IDO蛋白的表達(dá);高效液相色譜法(HPLC)檢測色氨酸(Trp)及其特異代謝產(chǎn)物犬尿氨酸(Kyn)的濃度,以判斷IDO活性。2.人外周血CD14+單核細(xì)胞在體外經(jīng)GM-CSF、IL-4培養(yǎng)6天誘導(dǎo)分化為未成熟DCs。加入200nmol/L繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),將培養(yǎng)后的成熟DCs分為2組:加入1 ng/ml 1-甲基-色氨酸(1-methyl tryptophan,1-MT)培養(yǎng)者為組2,未加入1 ng/ml 1-MT 者為組 1,每組 1.0 × 106/mlDCs。加入 1-MT10 小時(shí)后,和 Tregs(1.0× 105/ml)在6孔板中混合培養(yǎng)5天。western-blotthe檢測foxp3蛋白的表達(dá);ELISA檢測上清中IL-10的表達(dá)。結(jié)果:1、米非司酮處理后的DCs的IDO的表達(dá)和活性采用Real-time RT-PCR檢測IDO mRNA在DCs的表達(dá)。IDOmRNA表達(dá)在對照組,20nmol/L米非司酮組,65nmol/L米非司酮組和200nmol/L米非司酮組分別為:1,0.86±0.12,0.69±0.08 和 0.52 ±0.05。IDO mRNA 在樹突狀細(xì)胞的表達(dá)在65和200 nmol/L米非司酮組較對照組低(P.01)。65和200 mnol/L組間下調(diào)IDO呈劑量依賴性(P.05)。對照組和20 nmol/L米非司酮組間沒有明顯差異(P.05)。采用Western blot檢測IDO蛋白水平和采用Real-time RT-PCR檢測的IDO mRNA水平是一致的。IDO蛋白表達(dá)在對照組,20nmol/L米非司酮組,65nmol/L米非司酮組和200nmol/L米非司酮組分別為:0.94 ± 0.10,0.75 ± 0.11,0.67± 0.07 和 0.42 ± 0.23。為了評價(jià)IDO活性,我們用高效液相色譜法檢測Kyn/Trp比例。Kyn/Trp比例水平和IDO mRNA和蛋白水平一致。IDO活性在20nmol/L米非司酮組,65nmol/L米非司酮組和200nmol/L米非司酮組分別為1.39 ± 0.03,0.62 ± 0.01,0.12 士 0.02,對照組為 1.42 士 0.03。2、IDO抑制劑1-MT處理后FOXP3和IL-10的表達(dá)加入1-MT后,IDO 作用受抑制,FOXP3表達(dá)升高(0.12±0.01 vs.2.21±0.16.P0.01);Tregs 分泌 IL-10 升高(106.47±11.58 vs.327.01±15.95 P0.01)。結(jié)論米非司酮降低DCs中IDOmRNA及蛋白的表達(dá),降低IDO酶活性;IDO抑制劑1-MT可逆轉(zhuǎn)米非司酮處理后的DCs抑制Tregs表達(dá)FOXP3和IL-10,提示低劑量米非司酮通過降低IDO調(diào)節(jié)DCs功能。這可能是米非司酮避孕的免疫學(xué)機(jī)制。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 林其德;;復(fù)發(fā)性流產(chǎn)免疫學(xué)診斷和治療共識(shí)[J];生殖醫(yī)學(xué)雜志;2008年01期

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本文編號(hào)：1708633