本文選題：佐劑性關(guān)節(jié)炎　切入點(diǎn)：腎上腺素受體　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：腎上腺素受體（AR）作為神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵受體，可能參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。樹突細(xì)胞（DCs）作為功能強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用，可能在以下幾個(gè)方面參與RA的發(fā)病機(jī)制：DCs能激活淋巴器官中MHC限制性自身免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；DCs浸潤(rùn)至滑膜和滑液中，關(guān)節(jié)局部?jī)?nèi)攝取、處理、提呈抗原，促使RA遷延持續(xù)；DCs、滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞一起產(chǎn)生炎性介質(zhì)，進(jìn)一步刺激產(chǎn)生RA的炎癥免疫反應(yīng)等。成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要效應(yīng)細(xì)胞，其異常增殖，同時(shí)自身分泌的IL-1β、TNF-α和RANKL等炎性細(xì)胞因子加劇了局部的炎癥反應(yīng)。DCs和FLS均有AR的表達(dá)，，均可能參與對(duì)RA的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)，尤其是β-AR信號(hào)可能具有炎癥免疫調(diào)節(jié)的作用。本課題采用佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠模型，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、QRT-PCR、免疫熒光、免疫印跡等方法，通過(guò)觀察β-AR激動(dòng)藥（ISO）對(duì)DCs和FLS功能的影響，探討β-AR及其信號(hào)對(duì)DCs和FLS功能的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步研究該信號(hào)通路在AA大鼠DCs和FLS中的異常變化及部分機(jī)制，為揭示β-AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與RA異常炎癥免疫反應(yīng)的病理機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的：觀察β-AR信號(hào)對(duì)大鼠DCs和FLS功能的調(diào)節(jié)作用，探討AA大鼠DCs和FLS上β-AR信號(hào)的變化及對(duì)其功能的影響，為揭示β-AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與RA異常炎癥免疫反應(yīng)的病理機(jī)制以及藥物作用新靶點(diǎn)提供重要依據(jù)。 方法： 采用rIL-4、rGM-CSF刺激大鼠骨髓源細(xì)胞，誘導(dǎo)生成DCs；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表型CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表達(dá)和抗原攝取功能，F(xiàn)LS表面β2-AR的表達(dá)采用FITC標(biāo)記的二抗間標(biāo)法檢測(cè)，均以平均熒光強(qiáng)度表示表達(dá)的高低；MTT法檢測(cè)FLS的增殖及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）中T細(xì)胞的增殖；ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-10、TNF-α、RANKL、OPG和cAMP的水平；采用完全弗氏佐劑于大鼠足趾注射制得AA模型，β2-AR激動(dòng)藥灌胃給予，使用足爪儀測(cè)足爪容積計(jì)算足爪腫脹度，HE染色觀察關(guān)節(jié)病理，胸腺、脾臟重量與體重的比值表示胸腺、脾臟指數(shù)；免疫組化法檢測(cè)β2-AR在DCs和FLS上的分布；免疫熒光法檢測(cè)β2-AR在FLS上的表達(dá)情況；Western blot法檢測(cè)β2-AR、GRK2、β-arrestin2的膜表達(dá)和p-ERK的表達(dá)；QRT-PCR法檢測(cè)β2-AR mRNA、GRK2mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1. β-AR信號(hào)對(duì)AA大鼠DCs功能的影響 β-AR激動(dòng)藥ISO能明顯下調(diào)CD86、MHC-Ⅱ的表達(dá)，對(duì)CD80表達(dá)無(wú)明顯影響；ISO能明顯提高DCs的抗原攝取功能，升高IL-10的水平，抑制MLR。ISO主要通過(guò)β1-AR信號(hào)下調(diào)CD86的表達(dá)，通過(guò)β2-AR信號(hào)影響MHC-Ⅱ的表達(dá)、影響抗原的攝取功能、產(chǎn)生對(duì)MLR的影響。β2-AR激動(dòng)藥沙丁胺醇體內(nèi)給藥能顯著下調(diào)AA大鼠腸系膜淋巴結(jié)DCs和骨髓源DCs表面MHC-II的表達(dá)，提高DCs的吞噬能力，但對(duì)CD80、CD86的表達(dá)無(wú)明顯影響，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；β2-AR激動(dòng)藥沙丁胺醇能明顯降低AA大鼠足爪腫脹度，不同程度的改善關(guān)節(jié)的異常病理；能顯著降低AA大鼠的胸腺、脾臟指數(shù)，抑制T淋巴細(xì)胞，但對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)無(wú)明顯影響。 ISO處理后的AA模型組骨髓源DCs對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用明顯低于正常組，Western blot法檢測(cè)AA模型組大鼠骨髓源DCs胞膜中β2-AR表達(dá)明顯下降。AA病程中研究發(fā)現(xiàn)，致炎后d21、d28，β2-AR的膜表達(dá)顯著降低，GRK2的膜表達(dá)顯著升高；基因水平顯示，β2-AR mRNA、GRK2mRNA無(wú)顯著變化。 2. β-AR信號(hào)對(duì)AA大鼠FLS功能的影響 ISO能明顯抑制FLS的增殖，抑制FLS分泌IL-1β、TNF-α和RANKL的水平，促進(jìn)OPG的分泌水平，其抑制增殖作用主要通過(guò)β2-AR信號(hào)發(fā)揮。β2-AR激動(dòng)藥沙丁胺醇體內(nèi)給藥能抑制FLS的增殖反應(yīng)。 β2-AR在AA大鼠FLS胞膜的表達(dá)顯著下降，ISO對(duì)其增殖的抑制作用明顯降低，刺激后β2-AR的脫敏作用明顯高于正常對(duì)照組。AA大鼠FLS胞膜中GRK2、β-arrestin2的表達(dá)顯著升高。AA模型組cAMP水平明顯降低，經(jīng)ISO刺激后對(duì)照組和AA模型組cAMP水平均顯著升高，但AA模型組cAMP水平顯著低于對(duì)照組。AA模型組p-ERK水平顯著增高，經(jīng)ISO刺激，AA模型組p-ERK水平顯著高于對(duì)照組；與未刺激組相比，ISO能顯著升高AA模型組FLS p-ERK的水平，對(duì)對(duì)照組無(wú)明顯影響。 結(jié)論： 1. β2-AR信號(hào)參與了對(duì)DCs和FLS功能的調(diào)節(jié)。（1）β2-AR信號(hào)促進(jìn)DCs的抗原攝取，抑制其抗原的提呈功能。（2）β2-AR信號(hào)的激活可以抑制FLS增殖。 2. β2-AR信號(hào)在AA大鼠DCs和FLS中的異常改變是其對(duì)激動(dòng)藥反應(yīng)存在差異的原因。 （1）AA大鼠DCs和FLS中β2-AR膜表達(dá)下降是其對(duì)激動(dòng)藥反應(yīng)減弱的重要原因。 （2）AA大鼠GRK2、β-arrestin2轉(zhuǎn)膜的增加，導(dǎo)致β2-AR脫敏的增強(qiáng)，可能是β2-AR膜表達(dá)下降主要原因。 （3） β-arrestin2轉(zhuǎn)膜的增加，導(dǎo)致p-ERK表達(dá)的增高，也可能是AA大鼠FLS對(duì)β-AR激動(dòng)藥反應(yīng)減弱的原因。
[Abstract]:Adrenergic receptor (AR) as a key receptor neuroimmunoregulation, may be involved in rheumatoid arthritis (RA) in the process of occurrence, development. Dendritic cells (DCs) as a powerful antigen-presenting cells that play an important role in regulating the immune response in the pathogenesis of RA may be involved in the following aspects: DCs can activate the MHC restriction of autoimmune response in lymphoid organs, the immune response induced by DCs; infiltrating synovium and synovial fluid, joint local uptake, processing, presenting antigen, in DCs, prompted the RA to continue; synovial cells, macrophage cells to produce inflammatory mediators, further stimulates the production of RA inflammatory immune response. Fibroblast like synoviocytes (FLS) is the main effect of rheumatoid arthritis cells, the proliferation, and the secretion of IL-1 beta, TNF- alpha and RANKL inflammatory cytokines exacerbated the local inflammatory reaction of.DCs and FLS The expression of AR may be involved in neural immune regulation of RA, especially the beta -AR signal may have inflammatory immunomodulatory effects. The adjuvant arthritis (AA) rat model, using flow cytometry, QRT-PCR, immunofluorescence, Western blot method, through the observation of beta -AR excited the medicine (ISO) effects on DCs and FLS, to explore the role of beta -AR and its signal on DCs and FLS function, abnormal changes and some further studies on the mechanism of the signal transduction pathway in DCs and FLS in AA rats, to provide experimental basis for revealing the pathological mechanism of beta -AR signaling in immune RA abnormal inflammatory reaction.
Objective: To observe the effect of beta -AR signal on DCs and FLS function in rats, to investigate the DCs and FLS AA rat beta -AR signal changes and influence on its function, provide an important basis for revealing the pathological mechanism of beta -AR signaling in immune RA abnormal inflammatory response and drug targets.
Method錛

本文編號(hào)：1677270