本文選題：溶瘤病毒　切入點：OH2　出處：《湖北科技學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：目的本課題主要研究重組Ⅱ型單純皰疹病毒(OH2)基因組修飾的穩(wěn)定性,為OH2進一步研究提供依據(jù)。方法研究中涉及的實驗包括DNA提取、PCR產(chǎn)物酶切鑒定單純皰疹病毒的型別、PCR法驗證OH2基因修飾、細胞培養(yǎng)及ELISA檢測hGM-CSF含量。PCR產(chǎn)物酶切鑒定單純皰疹病毒的型別根據(jù)Ⅰ型和Ⅱ型單純皰疹病毒的gD糖蛋白保守序列設(shè)計,Ⅰ型單純皰疹病毒在該保守序列上有一個MspI酶切位點,而Ⅱ型單純皰疹病毒在該保守序列上則沒有MspI酶切位點。利用gD糖蛋白基因的保守序列內(nèi),設(shè)計一對引物,Ⅰ型和Ⅱ型單純皰疹病毒均可擴增出200bp的目的片段,將PCR產(chǎn)物用MspI酶切,Ⅰ型單純皰疹病毒獲得兩條條帶大小約為130bp及70bp,而Ⅱ型單純皰疹病毒及OH2酶切后條帶大小仍為200bp,可判斷OH2未受到廣泛存在于人群中的HSV-1污染。PCR法驗證基因修飾:根據(jù)被敲除或插入的序列及修飾位點上下游病毒核酸序列設(shè)計引物進行PCR擴增及電泳,并用電泳圖分析OH2基因組中是否剔除ICP34.5基因、ICP47基因及插入hGM-CSF基因。ELISA(夾心法)檢測hGM-CSF含量:以O(shè)H2培養(yǎng)上清為被檢樣本,實驗?zāi)康闹饕谴_定OH2病毒基因組中插入的hGM-CSF基因能否正常表達。選擇特異性一抗(hGM-CSF鼠源MAb)及二抗hGM-CSFAb-biotin,孵育后測OD值,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫軸,與空白對照孔的OD差值為縱軸,做標(biāo)準(zhǔn)曲線。被測樣品稀釋合適倍數(shù)(40-80倍),使其OD值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線類線性范圍內(nèi),將OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得hGM-CSF濃度,乘以稀釋倍數(shù)即為樣品中hGM-CSF含量。通過一系列被測樣品結(jié)果比對,樣品中hGM-CSF含量均超過2ng/ml。結(jié)果PCR產(chǎn)物酶切鑒定單純皰疹病毒的型別實驗中,Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)經(jīng)酶切實驗出現(xiàn)130bp和70bp兩條條帶,而Ⅱ型單純皰疹病毒和OH2PCR條帶和酶切條帶均只有一條,且為200bp。PCR驗證基因修飾實驗中OH2在四對引物下擴增,能擴增出對應(yīng)大小的目的條帶。ELISA實驗中hGM-CSF濃度在31.25-500pg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,且OH2中hGM-CSF表達量均大于2ng/ml。結(jié)論OH2經(jīng)基因修飾后型別未發(fā)生改變,修飾的基因穩(wěn)定存在,插入的hGM-CSF基因能夠穩(wěn)定的表達,且OH2經(jīng)傳代后,型別及修飾的基因穩(wěn)定存在,hGM-CSF表達穩(wěn)定。
[Abstract]:Objective to study the stability of recombinant herpes simplex virus type 2 (OH2) genome modification. Methods the experiments involved in the study included the identification of herpes simplex virus (HSV) by type polymerase chain reaction (PCR), which was used to identify herpes simplex virus (HSV) by restriction endonuclease digestion. The type of herpes simplex virus (HSV) was identified by restriction endonuclease digestion of cell culture and ELISA assay. The type of herpes simplex virus was designed according to the gd glycoprotein conserved sequence of herpes simplex virus type 鈪，

本文編號：1665376