本文選題：胰島素抵抗　切入點(diǎn)：794ap　出處：《重慶理工大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景Ⅱ型糖尿病(T2DM)是一種復(fù)雜的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病,已成為繼心血管疾病、惡性腫瘤之后第三大嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的非傳染性疾病。而胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ),并貫穿于Ⅱ型糖尿病的整個(gè)病理過(guò)程中。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferators activated receptors,PPARs)是人類(lèi)代謝相關(guān)疾病防治藥物的重要靶點(diǎn),屬于非甾體類(lèi)核受體超家族。其中PPARγ是研究胰島素抵抗的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一,參與眾多的復(fù)雜的信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng),比如PPARγ與PI3K-AKT激酶信號(hào)通路,PPARγ在PI3K信號(hào)通路中可以促進(jìn)AKT的表達(dá),增強(qiáng)胰島素敏感性,并促進(jìn)Glu T4基因的表達(dá),促進(jìn)對(duì)葡萄糖的攝取;PPARγ與ADIPOQ,脂聯(lián)素可以增加胰島素敏感性,具有抗炎保護(hù)內(nèi)皮等功能,是PPARγ激動(dòng)劑作用的新靶點(diǎn),能刺激AMPK磷酸化,許多效應(yīng)是通過(guò)AMPK途徑實(shí)現(xiàn)。PPARγ激動(dòng)劑主要是能通過(guò)作用于脂肪組織,促進(jìn)葡萄糖向脂肪組織轉(zhuǎn)運(yùn)、促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化等環(huán)節(jié),實(shí)現(xiàn)其胰島素增敏從而降低血糖的藥理作用。大量文獻(xiàn)表明高抑制CDK5介導(dǎo)的p-PPARγSer273的配體化合物是最佳的候選抗糖尿病藥物。前期研究發(fā)現(xiàn)794ap(昔美酸沙美特羅)能降低Ⅱ型糖尿病SD大鼠的血糖,后進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其與PPARγ受體結(jié)合度比較高。因此本文通過(guò)建立胰島素抵抗細(xì)胞模型并結(jié)合Western Blot、IHC、ICC和q RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法對(duì)794ap降糖并改善胰島素抵抗的作用機(jī)制進(jìn)行初步的探究。目的初步探討794ap改善胰島素抵抗及降糖的作用機(jī)制。方法運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)找出794ap與PPARγ的蛋白晶體結(jié)合的最佳構(gòu)象,采用分子動(dòng)力學(xué)模擬PPARγ受體激動(dòng)劑794ap與PPARγ受體的結(jié)合模式,用Amber做動(dòng)力學(xué)研究并使用MM-PBSA法計(jì)算其結(jié)合自由能。探索胰島素誘導(dǎo)的最佳濃度最佳濃度和時(shí)間,建立Hep G2胰島素抵抗模型。并用MTT法檢測(cè)794ap作用于Hep G2胰島素抵抗模型后,計(jì)算細(xì)胞的存活率并選擇合適的藥物濃度梯度并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道作為接下來(lái)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度;將794ap作用于Hep G2胰島素抵抗模型并做相應(yīng)的葡萄糖檢測(cè)試驗(yàn),以反應(yīng)藥物的效果;Western blot檢測(cè)蛋白含量,以羅格列酮作為陽(yáng)性藥物,觀(guān)察794ap對(duì)PPARγ、AMPKα1、AKT2、ADIPOQ、JAK2的影響;免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)和免疫組化組織(IHC)水平研究PPARγ等各蛋白在胰島素抵抗的Hep G2細(xì)胞及大鼠肝臟和胰腺組織中宏觀(guān)的表達(dá);q RT-PCR方法檢測(cè)PPARγ、ADIPOQ、AMPKα1 m RNA表達(dá)。結(jié)果794ap與受體2XKW和4EMA的復(fù)合物在進(jìn)行MD 30ns后都達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,形成穩(wěn)定的復(fù)合物結(jié)構(gòu)且794ap與受體2XKW結(jié)合的效果最好,范德華力在結(jié)合過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。成功建立Hep G2細(xì)胞胰島素抵抗模型,且WB實(shí)驗(yàn)顯示794ap能抑制p-PPARγSer273的表達(dá),上調(diào)p-PPARγSer112、AMPKα1、p-AMPKα1、ADIPOQ、p-AKT2的表達(dá),但794ap并不上調(diào)JAK2、p-JAK2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá);加入抑制劑T0070907后,794ap對(duì)PPARγ等蛋白表達(dá)的影響依舊不變;794ap對(duì)SD大鼠肝臟、胰腺組織和IR-Hep G2細(xì)胞PPARγ等蛋白的影響與WB結(jié)果一致;794ap上調(diào)ADIPOQ和AMPKα1的m RNA表達(dá),但并不增加PPARγm RNA表達(dá)水平。結(jié)論經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)研究證明794ap(昔美酸沙美特羅)能降低Ⅱ型糖尿病SD大鼠的血糖,改善胰島素抵抗。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果驗(yàn)證了794ap與PPARγ的受體結(jié)合緊密,理論上證明是PPARγ的激動(dòng)劑,且Western blot、IHC、ICC和q RT-PCR結(jié)果顯示794ap可以通過(guò)抑制p-PPARγSer273,上調(diào)AMPKα1、AKT2和ADIPOQ的表達(dá)來(lái)改善IR-SD大鼠和IR-Hep G2細(xì)胞的胰島素抵抗,增加其對(duì)胰島素的敏感性,從而產(chǎn)生降糖的作用。
[Abstract]:On the background of type II diabetes mellitus (T2DM) is a kind of complicated endocrine metabolic disorders, cardiovascular disease has become the third largest after malignant tumor, a serious threat to human health and non communicable disease. Insulin resistance is the basis of type II diabetes mellitus, and throughout the whole pathological process of type II diabetes mellitus. Peroxisome proliferation activated receptor (Peroxisome proliferators activated receptors, PPARs) is an important target for drug prevention and treatment of diseases related to human metabolism, which belongs to non steroidal nuclear receptor superfamily. PPAR gamma is one of the key target in the research of insulin resistance in complex, numerous signaling pathways and its biological effects, such as PPAR gamma and PI3K-AKT kinase signal pathway, PPAR gamma could promote the expression of AKT in the PI3K signaling pathway, enhance insulin sensitivity, and the expression of Glu T4 gene, promote In the uptake of glucose; PPAR gamma and ADIPOQ, adiponectin can increase insulin sensitivity, has anti-inflammatory and protect endothelial function, is a new target for PPAR gamma agonist, can stimulate the phosphorylation of AMPK, many effect is through the AMPK pathway.PPAR gamma agonist is mainly through effects on adipose tissue, promote glucose to promote the differentiation of adipose tissue transfer, and other aspects of fat cells, the insulin sensitizing and reduce blood glucose. The pharmacological effects of a large number of literatures show that compounds p-PPAR gamma Ser273 mediated suppression of CDK5 is the best candidate for anti diabetes drugs. Previous study found that 794ap (with beauty acid Shah Mette Lo) can reduce type II diabetes SD the blood sugar, after the study found that the molecular dynamics and PPAR gamma receptor binding is very high. So through the establishment of a cell model of insulin resistance and the combination of Western Blot, IHC, IC Preliminary study of mechanism of C and Q RT-PCR experimental method of 794ap glucose and improving insulin resistance. Objective to investigate the effects of 794ap on the insulin resistance and the hypoglycemic mechanism. The best conformation of protein crystal method using molecular docking technique to identify 794ap and PPAR gamma binding, binding mode using the molecular dynamics simulation of PPAR gamma receptor agonist 794ap with the PPAR gamma receptor, and calculate the binding energy using MM-PBSA method with Amber dynamics. To explore the best concentration of insulin induced the optimal concentration and time, the establishment of Hep G2 model of insulin resistance. And MTT was used to detect the effect of 794ap on the Hep G2 model of insulin resistance, calculate the cell survival rate and drug concentration gradient the right and the literatures as the next experimental drug concentration; 794ap in Hep G2 model of insulin resistance and the corresponding grape Sugar test, in response to the effects of drugs; protein content detection of Western blot, taking rosiglitazone as positive drug, the effect of 794ap on PPAR AMPK gamma, alpha 1, AKT2, ADIPOQ, JAK2; Immunocytochemistry (ICC) and immunohistochemistry (IHC) to study the expression of PPAR protein in insulin and other gamma G2 resistant Hep cells and rat liver and pancreas in macroscopic; RT-PCR method for detection of PPAR Q ADIPOQ, AMPK gamma, alpha 1 m RNA. Results the expression of 794ap complex and 2XKW receptor and 4EMA in MD 30ns after they reach a dynamic balance, the formation of a stable complex structure and the 794ap and 2XKW receptor binding the best, van Edward force plays a key role in the binding process. Establish insulin resistance cell model Hep G2, and WB test showed that 794ap could decrease the expression of p-PPAR gamma Ser273, upregulation of p-PPAR gamma Ser112, AMPK alpha 1, alpha 1, p-AMPK, ADIPOQ, p-AKT2 expression, but 7 94ap is not the upregulation of JAK2, p-JAK2, ERK1/2 and p-ERK1/2 protein expression; adding inhibitor T0070907, effects of 794ap on the expression of PPAR gamma protein remains unchanged; the 794ap of SD rat liver, pancreas and IR-Hep effect of G2 cells PPAR protein gamma etc. The results are consistent with the WB; 794ap AMPK m RNA upregulated ADIPOQ and alpha 1 the expression of PPAR, but did not increase the expression level of RNA gamma m. Conclusion through laboratory experiment proved that 794ap (early in beauty acid Shah Mette Lo) can reduce type II diabetes SD rats blood glucose, improve insulin resistance. The molecular dynamics simulation results prove the combination of 794ap and PPAR gamma receptor theory that is PPAR gamma agonist, Western and blot, IHC, ICC and Q RT-PCR results showed that 794ap can inhibit p-PPAR gamma Ser273, upregulation of AMPK alpha 1, expression of AKT2 and ADIPOQ to improve IR-SD rats and IR-Hep G2 cell insulin resistance, increase Its sensitivity to insulin, resulting in a hypoglycemic effect.

【學(xué)位授予單位】：重慶理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：1610562