本文選題：抗腫瘤　切入點：阿霉素　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在腫瘤的化學(xué)治療中,腫瘤細(xì)胞對長期使用的抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性是腫瘤治療領(lǐng)域的一大障礙。目前大多數(shù)觀點認(rèn)為,腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生與腫瘤細(xì)胞外排泵蛋白如P-gp糖蛋白和多藥耐藥蛋白(MRP)等的過量表達(dá)有關(guān)。過量表達(dá)的P-gp糖蛋白對游離的抗腫瘤藥物進(jìn)行識別,將通過被動擴(kuò)散進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的游離藥物又排出泵外,細(xì)胞內(nèi)部藥物濃度偏低而不能殺死腫瘤細(xì)胞,最終導(dǎo)致耐藥性�，F(xiàn)階段能克服腫瘤多藥耐藥的納米載藥系統(tǒng)主要包括：脂質(zhì)體、聚合物膠束、聚合物納米粒、無機(jī)納米藥物載體等。本課題設(shè)計了一種載藥系統(tǒng)來規(guī)避外排泵蛋白對藥物的識別,逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性,為克服腫瘤多藥耐藥這一難題開展一些探索。 阿霉素是蒽環(huán)類抗生素,是一種作用于DNA的抗腫瘤藥物,其抗菌譜廣,廣泛應(yīng)用于腫瘤治療,因此本課題采用阿霉素作為模型藥物進(jìn)行研究。以阿霉素為模型藥物的載藥系統(tǒng)主要有脂質(zhì)體、膠束、聚合物載體等,利用這些納米載藥系統(tǒng)克服腫瘤多藥耐藥取得了一定的效果。目前多種針對細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境刺激響應(yīng)釋放的載藥系統(tǒng)被設(shè)計出來,其中谷胱甘肽還原響應(yīng)型釋放載藥系統(tǒng)更是成為研究熱點。本課題設(shè)計了谷胱甘肽還原響應(yīng)型釋放載藥系統(tǒng)以達(dá)到即可以規(guī)避外排泵識別藥物,逆轉(zhuǎn)多藥耐藥,又可以響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境使藥物達(dá)到控釋的效果。該載藥系統(tǒng)的設(shè)計思路是：以粒徑可控、生物相容性良好的金納米粒為載藥核心,通過化學(xué)反應(yīng)合成含有游離巰基的巰基化阿霉素,金納米粒與巰基化阿霉素共價鍵結(jié)合形成載藥金納米粒,為促進(jìn)載藥金納米粒更好的進(jìn)入細(xì)胞,通過靜電作用在其表面引入生物可還原型的聚酰胺-胺類陽離子材料,構(gòu)建了具有谷咣甘肽還原響應(yīng)型的ss-PAA包覆的金納米粒載藥系統(tǒng)。 本文從四部分闡述了ss-PAA包覆的金納米粒載藥系統(tǒng)的構(gòu)建及其谷胱甘肽刺激響應(yīng)的釋放行為及逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的研究。 論文的第一部分首先是材料的制備及表征,這一部分包括了載藥核心金納米粒的制備及表征、谷胱甘肽還原響應(yīng)型陽離子材料ss-PAA的制備及表征。本課題采用檸檬酸三鈉還原法制備金納米粒,通過激光粒度儀、紫外分光光度計、透射電子顯微鏡表征金納米粒的粒徑、電位、SPR特征吸收峰以及形態(tài)。實驗結(jié)果顯示,檸檬酸三鈉還原法制備的金納米粒粒徑18±2.3nm,電位-38.4±4.3mV,在波長為523nm處存在SPR特征吸收峰,形態(tài)為規(guī)則的球形顆粒并且粒徑均勻,納米粒之間無粘連現(xiàn)象。ss-PAA的制備則由4-氨基-1-丁醇(ABOL)和胱胺雙丙烯酰胺(CBA)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)聚合而成,利用核磁手段對其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,證明ss-PAA成功合成。 第二部分,首先采用化學(xué)合成方法對阿霉素進(jìn)行巰基化修飾,通過核磁、質(zhì)譜和高效液相色譜圖譜對合成的巰基化阿霉素進(jìn)行分析,核磁圖譜顯示巰基阿霉素特征峰的質(zhì)子信號存在,質(zhì)譜結(jié)果顯示阿霉素分子離子峰由544增至616；高效液相色譜結(jié)果顯示,阿霉素的出峰時間由7min左右變至10min左右,表明巰基化阿霉素合成成功。借助熒光分光光度法和高效液相色譜法建立了巰基化阿霉素的含量測定方法。實驗結(jié)果顯示,巰基化阿霉素濃度在0.25～16μg·mL-1范圍內(nèi)與樣品吸光度值及色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系R2分別為0.9997和0.9998,直線回歸方程分別為：C=0.0066A-0.0211和C=0.0002A-0.2204,經(jīng)驗證方法的線性、精密度、準(zhǔn)確度、專屬性均符合測定要求,為后期實驗中測定巰基化阿霉素的吸附量和吸附效率以及巰基化阿霉素的谷胱甘肽還原響應(yīng)釋放提供了測定依據(jù)。 第三部分構(gòu)建了谷胱甘肽還原響應(yīng)型金納米顆粒載藥系統(tǒng),并對該載藥系統(tǒng)進(jìn)行表征及對載藥系統(tǒng)的載藥量、載藥效率及體外釋放進(jìn)行了考察。金納米粒吸附巰基化阿霉素及ss-PAA之后,粒徑逐漸增大,由18±2.3nm增至80.5±6.8nm,電位也由-38.4±4.3mV轉(zhuǎn)變?yōu)?2.3±5.2mV。紫外光譜分析表明,金納米粒吸附巰基化阿霉素和ss-PAA之后,最大吸收波長出現(xiàn)2-3nm的紅移現(xiàn)象,證明載藥系統(tǒng)的成功構(gòu)建。采用熒光分光光度法對金納米粒吸附巰基阿霉素的吸附量和吸附效率進(jìn)行考察,實驗結(jié)果顯示,巰基化阿霉素濃度在0.25～16μg·mL-1范圍內(nèi)與熒光吸光度值A(chǔ)呈良好的線性關(guān)系(r=0.9998),線性回歸方程為C=0.0002A-0.2204。經(jīng)測定,方法的精密度、準(zhǔn)確度、回收率等均符合藥物含量測定的要求。逐漸增大金納米粒／巰基阿霉素的摩爾比,未被吸附的上清液中游離的巰基化阿霉素的峰面積及熒光強(qiáng)度逐漸降低,表明隨著金納米粒的摩爾濃度增加,吸附的巰基化阿霉素的量也相應(yīng)增加。當(dāng)金納米粒的摩爾濃度為7.5nM時,吸附的巰基阿霉素為10.84μ M。用谷胱甘肽(GSH)對載藥系統(tǒng)進(jìn)行處理,結(jié)果表明,在GSH存在條件下,阿霉素能迅速從載藥系統(tǒng)中得以釋放。 第四部分以乳腺腫瘤細(xì)胞系MCF-7的敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞為研究對象,采用CCK8法比較了載藥系統(tǒng)對MCF-7敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒性,在MCF-7敏感細(xì)胞中,DOX、DOX-SH@Au.DOX-SH@Au@ss-PAA的IC50值分別是0.74±0.15、10.52±1.21、2.58±0.24μ M,游離巰基阿霉素的細(xì)胞毒性分別強(qiáng)于金納米粒載巰基阿霉素組和ss-PAA包覆的金納米粒載筑基阿霉素組,而在耐藥細(xì)胞中,DOX、 DOX-sH@Au.DOX-SH@Au@ss-PAA的IC50值分別是2.53±0.21、11.58±1.42、1.91±0.17u M,ss-PAA包覆的金納米粒載巰基阿霉素組的細(xì)胞毒性均強(qiáng)于游離藥物組和金納米粒載巰基阿霉素組。兩種細(xì)胞經(jīng)過GSH處理后,載藥系統(tǒng)對兩種細(xì)胞的細(xì)胞毒性均強(qiáng)于未用GSH處理組。通過激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞技術(shù)觀察了載藥系統(tǒng)對GSH的響應(yīng)釋放情況,實驗結(jié)果均表明,加入GSH之后,阿霉素的熒光顯著增強(qiáng),表明載藥系統(tǒng)能夠在細(xì)胞內(nèi)GSH的刺激下響應(yīng)釋放阿霉素。在對耐藥細(xì)胞的觀察中,加入GSH后,載藥金納米顆粒組和包覆ss-PAA的載藥金納米顆粒組的熒光明顯強(qiáng)于游離巰基阿霉素組,表明載藥系統(tǒng)能規(guī)避外排泵蛋白的識別,將更多的阿霉素載入細(xì)胞。 本課題針對腫瘤多藥耐藥性的難題,設(shè)計了細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽響應(yīng)性的金納米粒載藥系統(tǒng),研究表明了我們設(shè)計的載藥系統(tǒng)能在谷胱甘肽的刺激響應(yīng)下釋放阿霉素,增加阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的濃度,在一定程度上能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性,對改善腫瘤的化學(xué)治療具有一定意義。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R91;R96

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本文編號：1609391