本文選題：酶標納米金探針　切入點：石杉堿甲　出處：《福建中醫(yī)藥大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：石杉堿甲(HupA)是一種高效且可逆的乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑,是目前治療老年癡呆癥(又稱阿爾茨海默病,AD)最有前景的藥物。隨著世界人口老齡化的加快,阿爾茨海默病患者逐年增加,國內(nèi)外對其需求量日益增加。當前醫(yī)學界尚沒有發(fā)現(xiàn)合適的HupA替代品,人工合成法也局限于實驗室使用,目前HupA主要從石杉屬和馬尾杉屬等植物中提取獲得,然而該類植物野生資源匱乏,且HupA含量甚微。因此建立高靈敏度的HupA檢測方法,對充分利用該類資源具有十分重要的現(xiàn)實意義。近年來,納米技術發(fā)展迅速,尤其是納米金標記技術備受業(yè)界關注。該技術具有簡便、快速、準確及無毒等優(yōu)點,為藥物的分析測定提供一種新的研究思路。納米金的表面積大、生物兼容性好,其表面能夠通過靜電作用與抗體、酶等生物大分子相結合,還可以與巰基或PolyA修飾的DNA相結合,形成探針后后生物分子的活性基本不受影響,且性質(zhì)較為穩(wěn)定,這些功能化的納米金探針用于免疫分析中,可顯著提高方法的檢測靈敏度。免疫磁珠(磁珠探針)是近年來新興的一種功能材料,指偶聯(lián)了抗原或抗體的磁性微球。磁珠具有較強的磁響應性,通過引入磁場,可以實現(xiàn)快速分離、富集目標物,具有操作簡便、快速高效和不影響生物活性等優(yōu)點,在免疫分析領域、細胞分離等方面具有獨特的優(yōu)越性。本論文利用納米金探針和磁珠探針的特性,以競爭免疫分析為基礎,研發(fā)了檢測HupA的新型酶標免疫分析方法,并應用于實際樣品的含量測定,為藥物中有效成分的微量測定提供新的分析策略。論文共分為三章,主要內(nèi)容如下:第一章:酶標納米金探針檢測石杉堿甲的方法研究。采用檸檬酸三鈉還原法合成納米金,將酶和抗體修飾于納米金顆粒表面制備納米金探針,并對探針制備條件進行優(yōu)化,如標記pH、最適抗體標記量、酶和抗體標記比例等,采用紫外分光光度法和透射電鏡對制備好的納米金探針進行表征。將制備好的納米金探針引入到免疫分析中,采用競爭免疫分析模式,建立了一種檢測HupA的新方法。并對實驗條件如包被抗原和納米金探針稀釋比例、最佳競爭反應時間進行了優(yōu)化,在最佳實驗條件下,該方法測定HupA的線性范圍為0.5～150ng/mL,線性方程為1=0.2985 lgC+0.1704(r=0.9960),檢測限為602.56 pg/mL。將該法應用于蛇足石杉中HupA含量測定,經(jīng)國標法驗證,二者測定結果基本一致,回收率在97.08～106.11%之間,結果較好。該法檢測時間短,靈敏度高且重復性好,是一種簡便、高效、經(jīng)濟的檢測體系,有利于推廣應用。第二章:磁珠和酶標納米金探針檢測石杉堿甲的方法研究。本研究引入磁性載體-磁珠,代替?zhèn)鹘y(tǒng)的96孔酶標板,將石杉堿甲完全抗原(HupA-OVA)標記在磁珠上�；诖判苑蛛x,利用納米金探針,建立了快速、高效、靈敏度高的檢測石杉堿甲的酶標免疫新方法�？疾觳�(yōu)化了磁珠探針和納米金探針的稀釋比例、最佳競爭反應時間等免疫分析條件,最終確立了檢測體系,在優(yōu)化實驗條件下,該方法在HupA濃度為0.075～180ng/mL之間,抑制率與HupA濃度的對數(shù)值lgC呈良好的線性關系,線性方程為I=0.2813 lgC+0.3051(r=0.9950),檢測限為160.32 pg/mL。將該法應用于石杉堿甲片劑含量測定,檢測結果與國標法所測結果基本一致,該方法的靈敏度較前一種方法更高、線性范圍更寬且縮短了檢測時間。第三章:磁珠和DNA-納米金探針檢測石杉堿甲的方法研究。在前兩種方法研究的基礎上,基于磁珠建立了 DNA-納米金探針檢測方法,并對該方法的精密度、重復性、專屬性等進行了考察,結果均在允許范圍內(nèi),該方法在HupA濃度為0.008～16 ng/mL之間,抑制率與HupA濃度的對數(shù)值lgC呈良好的線性關系,線性方程為I=0.3006 lgC+0.6142(r=0.9952)檢測限為19.41pg/mL。并對蛇足石杉內(nèi)生真菌發(fā)酵液中HupA進行了檢測,加標回收率在99.33～103.73%之間,結果令人滿意。DNA的引入進一步提高了方法的靈敏度,此方法較前兩種方法靈敏度更高。
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【學位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R927.1

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本文編號：1577689