發(fā)布時(shí)間：2018-02-27 18:04

  本文關(guān)鍵詞： 肥厚心肌 缺血后適應(yīng) 基因 心肌缺血再灌注損傷 主動(dòng)脈弓縮窄 重組9型腺相關(guān)病毒　出處：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：本研究旨在通過觀察主動(dòng)脈弓縮窄（TAC）后壓力誘導(dǎo)的小鼠肥厚心肌和正常心肌缺血后適應(yīng)對心肌保護(hù)作用及RISK信號通路表達(dá)的差異，探討肥厚心肌小鼠缺血再灌注損傷的分子生物學(xué)機(jī)制。并進(jìn)一步以攜帶CaMEK基因的重組9型腺相關(guān)病毒（rAAV9），靶向性增強(qiáng)小鼠肥厚心肌RISK信號通路表達(dá)以達(dá)到增強(qiáng)肥厚心肌缺血后適應(yīng)對心臟的保護(hù)作用。本研究包括：⑴建立小鼠肥厚心肌模型，研究小鼠正常心肌和肥厚心肌缺血后適應(yīng)對心肌保護(hù)作用及ERK1/2信號通路、PI3K-Akt信號通路表達(dá)的差異。⑵探討rAAV9-eGFP對小鼠正常心肌和肥厚心肌轉(zhuǎn)染的有效性和安全性。⑶應(yīng)用rAAV9-CaMEK基因靶向性增強(qiáng)小鼠肥厚心肌ERK1/2信號通路，觀察缺血后適應(yīng)能否有效減少小鼠肥厚心肌的缺血再灌注損傷。方法：課題第一部分：近交系C57BL/6（10周齡）雄性小鼠110只，按1:1比例隨機(jī)分為TAC組和假手術(shù)組（Sham），⑴選取兩組小鼠各20只觀察術(shù)后0w，1w，3w，5w經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖、組織重量和心肌病理學(xué)檢測。其余兩組小鼠各35只，術(shù)后5w采用Langendorff離體心臟灌流裝置建立缺血再灌注（I/R）和缺血后適應(yīng)（IPostC）模型，測定離體心臟血液動(dòng)力學(xué)，采用氯化三苯四氮唑（TTC）染色確定心肌梗死面積和終末脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位末端缺口標(biāo)記法（TUNEL）計(jì)算心肌凋亡細(xì)胞。⑵應(yīng)用Western Blot法檢測兩組術(shù)后5w ERK1/2、Akt、P70S6K、GSK-3β總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平。課題第二部分：116只C57BL/6（10周齡）小鼠按1:1比例隨機(jī)分為TAC組和Sham組，5w后TAC組再隨機(jī)分為7個(gè)病毒亞組，每組6只。Sham組再隨機(jī)分為4個(gè)對照亞組，每組4只。病毒亞組經(jīng)尾靜脈注射攜帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的rAAV9（rAAV9-eGFP），對照亞組注射同等劑量的生理鹽水。隨機(jī)各取4組于0d、21d、35d、60d測定經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖和血液生化指標(biāo)，病毒亞組并于0d、7d、14d、21d、28d、35d、60d使用熒光顯微鏡觀察eGFP在心、肝、肺、腎、腦、骨骼肌的熒光表達(dá)，同時(shí)Western Blot法檢測eGFP的蛋白表達(dá)。課題第三部分：⑴24只C57BL/6（10周齡）小鼠按1:1:1:1比例隨機(jī)分為Sham組，TAC組，TAC-eGFP組和TAC-CaMEK組，分別經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水，生理鹽水，rAAV9-eGFP和rAAV9-CaMEK。于1w后第1組行Sham，余3組分別行TAC。術(shù)后5w采用WesternBlot法和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法（rt-PCR）檢測心肌組織MEK表達(dá)。⑵另選40只小鼠按1:1隨機(jī)分組，術(shù)前1w經(jīng)尾靜脈分別注射rAAV9-eGFP和rAAV9-CaMEK，術(shù)后5w采用Langendorff離體心臟灌流裝置建立I/R和IPostC模型，，TTC染色的方法確定心肌梗死面積，TUNEL法計(jì)算心肌凋亡細(xì)胞。⑶另選30只小鼠術(shù)前1w經(jīng)尾靜脈注射rAAV9-CaMEK，后行TAC。術(shù)后0w，1w，3w，5w經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查，術(shù)后5w隨機(jī)選擇5只小鼠測定血液生化指標(biāo)和組織重量，其余25只采用Langendorff離體心臟灌流裝置建立I/R和IPostC模型，測定離體心臟血液動(dòng)力學(xué)，應(yīng)用WesternBlot法檢測ERK1/2、Akt、P70S6K、GSK-3β總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：課題第一部分：⑴超聲顯示TAC組Awsth、Awdth、Pwsth、Pwdth、LVEDD在術(shù)后3w、5w與同時(shí)間點(diǎn)Sham組比較均顯著增加（P＜0.05），TAC組Awsth、Pwsth、Pwdth術(shù)后5w相比術(shù)后3w均顯著增加（P＜0.05）；TAC組HW、LVW、LVW/BW、HW/TL、LVW/TL在術(shù)后3w、5w與同時(shí)間點(diǎn)Sham組比較均顯著增加（P＜0.05），TAC組HW、LVW、LVW/BW、HW/TL、LVW/TL術(shù)后5w相比術(shù)后3w時(shí)間點(diǎn)均顯著增加（P＜0.05）；HE染色TAC組3w、5w后表現(xiàn)為心肌細(xì)胞明顯肥大；TAC組IPostC與IR比較，LVSP、LVDP、dp/dtmax、dp/dtmin均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；TAC組IPostC后心肌梗死面積與I/R組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[（46.47±6.14）%Vs （50.26±9.41）%，P＞0.05]，同時(shí)顯著高于Sham組IPostC[（46.47±6.14）%Vs （31.62±5.32）%，P＜0.05]。TAC組IPostC后TUNEL陽性細(xì)胞與I/R比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[（41±1.6）%Vs（44±2.8%），P＞0.05]，同時(shí)顯著高于Sham組IPostC[（41±1.6）%Vs （12±1.6%），P＜0.05]。⑵Western Blot法提示Sham組IPostC處置后ERK1/2和P70S6K磷酸化蛋白水平較I/R比較顯著增強(qiáng)（P＜0.05），TAC組IPostC處置較I/R比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），兩組Akt和GSK-3β磷酸化蛋白水平無明顯變化。課題第二部分：經(jīng)尾靜脈注射rAAV9-eGFP后，在熒光顯微鏡下觀察心肌組織冰凍切片，eGFP在正常心肌和肥厚心肌7d起表達(dá)，35d轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到高峰，轉(zhuǎn)染效率分別為42%和46%，觀察至60d持續(xù)高峰表達(dá)。eGFP具有心和肝的靶向性。Western Blot法eGFP蛋白表達(dá)與上述趨勢一致。觀察期內(nèi)與未注射rAAV9-eGFP組比較超聲心動(dòng)圖、血液生化指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。課題第三部分：⑴通過Western Blot法和rt-PCR法檢測心肌細(xì)胞MEK表達(dá)，rAAV9-CaMEK組較Sham組，TAC組，TAC-eGFP組顯著增高（P＜0.05）。⑵rAAV9-CaMEK組IPostC后心肌梗死面積顯著低于I/R[（34.05±5.73）%Vs （42.73±7.38）%，P＜0.05]，同時(shí)顯著低于TAC-eGFP組IPostC（[34.05±5.73）%Vs （51.34±6.90）%，P＜0.05]。TAC-CaMEK組IPostC后TUNEL陽性細(xì)胞顯著低于I/R [（14±3.0）%Vs （36±1.6%），P＞0.05]，同時(shí)顯著低于TAC-eGFP組IPostC [（14±3.0）%Vs （44±1.5）%，P＜0.05]。⑶TAC-CaMEK組超聲心動(dòng)圖檢測術(shù)后3w、5w的Awsth、Awdth、Pwsth、Pwdth、LVEDD與術(shù)前比較均明顯增加（P＜0.05），術(shù)后5w的Awsth、Pwsth、Pwdth與術(shù)后3w比較均明顯增加（P＜0.05）；血液生化指標(biāo)與相關(guān)參考值比較未見顯著差異；HW、LVW、LVW/BW、HW/TL、LVW/TL在術(shù)后5w與同時(shí)間點(diǎn)Sham組比較均顯著增加（P＜0.05）。與同時(shí)間點(diǎn)TAC比較無顯著差異（P＞0.05）；IPostC組與IR組比較，LVSP、LVDP、dp/dtmax、dp/dtmin、dp/dtmin均顯著升高（P＜0.05）；Western Blot法提示rAAV9-CaMEK組IPostC處置后ERK1/2和P70S6K磷酸化蛋白水平較I/R比較顯著增強(qiáng)（P＜0.05），且ERK1/2和P70S6K磷酸化蛋白水平可以達(dá)到SH組IPostC水平（P＞0.05），Akt和GSK-3β磷酸化蛋白水平無明顯變化。結(jié)論：⑴通過建立小鼠TAC模型誘導(dǎo)心肌肥厚發(fā)現(xiàn)，3w后心肌即可出現(xiàn)穩(wěn)定性肥厚，且5w內(nèi)呈一穩(wěn)定的病理生理改變，心功能未見異常。通過TAC5w后成功建立的小鼠LVH模型，進(jìn)行離體心臟缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)小鼠肥厚心肌的IPostC保護(hù)作用較正常心肌明顯減弱，表現(xiàn)在心功能減退、心肌梗死面積增大和心肌凋亡細(xì)胞顯著增多。肥厚心肌ERK1/2-P70S6K信號通路不能被有效的激活是造成上述原因的關(guān)鍵。⑵經(jīng)尾靜脈注射rAAV9-eGFP報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)正常心肌和肥厚心肌35d轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到高峰，60d持續(xù)表達(dá)。具有心和肝的靶向性。觀察期內(nèi)對肝腎功能無影響。⑶經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入rAAV9-CaMEK基因，通過Western Blot和rt-PCR方法觀察5w可有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)入心肌細(xì)胞，靶向性激活MEK，結(jié)果顯示IPostC可以有效激活肥厚心肌的ERK1/2-P70S6K信號通路磷酸化表達(dá)，從而改善其心功能，減少心肌梗死面積和心肌凋亡細(xì)胞，達(dá)到了類似正常心肌IPostC的保護(hù)作用。觀察期內(nèi)rAAV9-CaMEK對心功能和肝腎功能均無影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R965


本文編號：1543739