本文關(guān)鍵詞： 乙醛 腺苷受體 肝星狀細胞 環(huán)磷酸腺苷 蛋白激酶A 環(huán)磷腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白　出處：《安徽醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是由于長期大量飲酒導致的肝臟疾病，酒精性肝纖維化是ALD進展為酒精性肝硬化的中間階段和必經(jīng)病理過程，如何預(yù)防和逆轉(zhuǎn)其形成已成為學術(shù)界關(guān)注的熱點。在酒精性肝纖維化發(fā)生過程中，乙醇可通過其代謝產(chǎn)物乙醛激活肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)�；罨腍SC是肝纖維化過程中細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)的主要來源，也是各種因素所致肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。因此，抑制HSC的活化和增殖是目前治療肝纖維化的主要策略。 近年來，隨著腺苷受體(adenosine receptors, ARs)亞型選擇性激動劑和拮抗劑的開發(fā)，人們對腺苷及其受體的作用研究越來越深入，并逐步認識到腺苷A1(adenosine A1receptor, A1R)和A2A受體(adenosine A2A receptor, A2AR)在酒精性脂肪肝以及肝纖維化的發(fā)病機制中發(fā)揮不可忽視的作用。Chan等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)乙醇誘導后釋放的大量腺苷通過激活HSC腺苷A2AR，促進大鼠和人HSC膠原合成，Peng等研究表明缺乏或阻斷腺苷A1R可減少小鼠酒精性脂肪肝的發(fā)生。本課題組前期研究也表明Caffeine作為非選擇性腺苷受體拮抗劑能夠顯著抑制乙醛誘導的HSC-T6活化，并且顯著降低HSC-T6中TGF-β1和CTGF的表達水平，其機制可能與拮抗腺苷A2AR介導的信號通路有關(guān)。 因此，我們推測在酒精性肝纖維化形成過程中，腺苷A1R與A2AR均可能調(diào)控HSC活化增殖。但由于對cAMP-PKA依賴途徑的相反調(diào)節(jié)作用，二者可能具有不同的效應(yīng)。為進一步闡明腺苷A1R與A2AR信號通路調(diào)控HSC活化增殖的作用，本研究采用乙醛干預(yù)正常大鼠分離的HSC，制備離體大鼠酒精性肝纖維化HSC模型；并在此基礎(chǔ)上，觀察HSC腺苷A1R和A2AR表達水平，以及腺苷A1R和A2AR介導的cAMP信號通路調(diào)控HSC活化增殖的作用。主要內(nèi)容概括如下： 1.HSC的分離、培養(yǎng)與鑒定 取雄性Sprague-Darwley(SD)大鼠(300-450g)，10%水合氯醛(3ml/kg)麻醉，常規(guī)消毒，分離門靜脈并插管，采用鏈酶蛋白酶、Ⅳ型膠原酶依次灌注，37℃原位消化，經(jīng)Nycodenz密度梯度離心分離HSC，在含20%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。臺盼藍拒染實驗鑒定細胞活力，并分別于1d，2d，7d和14d進行拍照，鑒別細胞的分化程度。結(jié)果顯示，HSC得率為1×107個/肝，HSC存活率為95%。 2.腺苷A1R和A2AR在大鼠酒精性肝纖維化HSC模型中的表達 由前期研究可知，乙醛在200μM，作用48h時，HSC增殖最為明顯。因此我們選之作為離體大鼠酒精性肝纖維化HSC模型的的造模條件，并同時設(shè)正常HSC對照組，采用實時定量PCR法及Western blot法檢測HSC中腺苷A1R和A2AR表達水平。結(jié)果顯示，腺苷A1R和A2AR在正常HSC均有表達，且腺苷A2AR表達水平明顯高于A1R；與正常組比較，經(jīng)200μM乙醛作用48h后，HSC模型組腺苷A1R和A2AR表達水平明顯增高。結(jié)果表明，大鼠酒精性肝纖維化HSC模型及正常大鼠分離的HSC均表達腺苷A1R和A2AR，且在HSC模型組表達明顯增高。 3.腺苷A1R介導的cAMP信號通路在大鼠酒精性肝纖維化HSC模型中的作用 將HSC按1×105個/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24h后，隨機分組進行實驗。實驗設(shè)正常對照組(常規(guī)培養(yǎng))，模型組，百日咳毒索(pertussis toxin, PTX)組，非選擇性ARs激動劑NECA組，NECA+PTX組。除正常對照組外其余各組均以200μM乙醛作用48h，制備大鼠酒精性肝纖維化HSC模型。然后PTX組及NECA+PTX組給予PTX(100ng/ml)預(yù)處理HSC24h，在此基礎(chǔ)上，NECA組及NECA+PTX組再給予NECA(10μM)與HSC共培養(yǎng)10min，ELISA法檢測HSC內(nèi)cAMP含量，Western blot法檢測PKA及磷酸化CREB蛋白的表達。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組cAMP含量及其信號通路中關(guān)鍵信號分子PKA、磷酸化CREB蛋白的表達明顯升高，PTX和NECA均能進一步升高模型組cAMP含量，以及PKA和磷酸化CREB蛋白的表達，且PTX預(yù)處理顯著增強NECA的效應(yīng)。結(jié)果提示，在HSC存在AR-Gi/o-AC-cAMP信號通路，PTX作為Gi/o蛋白耦聯(lián)受體抑制劑，通過抑制Gi/o-AC-cAMP通道，進而加強了非選擇性ARs激動劑經(jīng)A2AR-Gs-AC-cAMP通道促進cAMP生成的作用。 為進一步闡明腺苷A1R及其介導的cAMP信號通路在大鼠酒精性肝纖維化HSC模型中的作用，分別以腺苷A1R激動劑CPA (1μM)、腺苷A1R拮抗劑DPCPX(10nM)、CPA+DPCPX與HSC模型共培養(yǎng)48h，采用實時定量PCR法及Western blot法檢測α-SMA、Collagen I、Collagen III的表達情況。結(jié)果顯示經(jīng)乙醛作用48h后，模型組HSC α-SMA、Collagen I、Collagen III表達明顯增強，經(jīng)DPCPX處理后均明顯下降，而CPA作用能進一步促進模型組HSC α-SMA、Collagen I、Collagen III表達水平。同時，與單獨用藥組比較，CPA+DPCPX聯(lián)合用藥組上述作用明顯逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明乙醛可能通過激活HSC內(nèi)腺苷A1R促進HSC活化增殖，腺苷A1R拮抗劑對其具有一定的抑制作用。 進一步研究顯示，經(jīng)CPA處理后，模型組HSC中cAMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表達明顯下降。而DPCPX作用能進一步升高模型組cAMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表達水平。同時，與單獨用藥組比較，CPA+DPCPX聯(lián)合用藥組上述作用明顯逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明A1R-Gi/o-AC-cAMP-PKA-CREB信號通路在乙醛誘導的HSC活化增殖中具有一定的作用。 4.腺苷A2AR介導的cAMP信號通路在大鼠酒精性肝纖維化HSC模型中的作用 將HSC按1×105個/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24h后，隨機分組進行實驗。實驗設(shè)正常對照組(常規(guī)培養(yǎng))，模型組，磷酸二酯酶(IV)抑制劑Rolipram組，NECA組，NECA+Rolipram組，除正常對照組外其余各組均以200μM乙醛作用48h，制備大鼠酒精性肝纖維化HSC模型。然后Rolipram組及NECA+Rolipram組給予Rolipram(10μM)預(yù)處理HSC15min，在此基礎(chǔ)上，NECA組及NECA+Rolipram組再給予NECA(10μM)與HSC共培養(yǎng)10min，，ELISA法檢測HSC內(nèi)cAMP含量，Western blot法檢測PKA及磷酸化CREB蛋白的表達。結(jié)果與前述一致，與正常組比較，模型組cAMP含量及其信號通路中關(guān)鍵信號分子PKA、磷酸化CREB蛋白的表達明顯升高，Rolipram和NECA均顯著升高模型組cAMP含量，以及PKA和磷酸化CREB蛋白的表達，Rolipram+NECA則具有進一步的升高作用。細胞內(nèi)cAMP含量增高主要有兩條途徑：一是激動ARs；二是抑制胞內(nèi)磷酸二酯酶的活性，研究結(jié)果表明Rolipram作為磷酸二酯酶(IV)抑制劑顯著增加cAMP含量，而NECA作為非選擇性AR激動劑同樣顯著增加cAMP含量，提示在HSC存在AR-Gs-AC-cAMP信號通路。 為進一步闡明腺苷A2AR及其介導的cAMP信號通路在大鼠酒精性肝纖維化HSC模型中的作用，分別以腺苷A2AR激動劑CGS21680(1μM)、腺苷A2AR拮抗劑ZM241385(1μM)以及CGS21680+ZM241385與HSC共培養(yǎng)48h，采用實時定量PCR法及Western blot法檢測α-SMA、Collagen I、Collagen III的表達情況。結(jié)果顯示經(jīng)乙醛作用48h后，模型組HSC α-SMA、Collagen I、Collagen III表達明顯增強，經(jīng)ZM241385處理后均明顯下降，而CGS21680作用能進一步促進模型組α-SMA、Collagen I、Collagen III表達水平。同時，與單獨用藥組比較，ZM241385+CGS21680聯(lián)合用藥組上述作用明顯逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明乙醛可能通過激活HSC內(nèi)腺苷A2AR促進HSC活化增殖，腺苷A2AR拮抗劑對其具有一定的抑制作用。 進一步研究顯示，經(jīng)ZM241385處理后，模型組HSC中cAMP含量及PKA、p-CREB蛋白表達明顯下降。而CGS21680作用能進一步升高模型組cAMP含量及PKA、p-CREB蛋白表達水平。同時，與單獨用藥組比較，ZM241385+CGS21680聯(lián)合用藥組上述作用明顯逆轉(zhuǎn)。結(jié)果表明A2AR-Gs-AC-cAMP-PKA-CREB信號通路在乙醛誘導的HSC活化增殖中具有一定的作用。 綜上所述，在大鼠酒精性肝纖維化HSC模型中，腺苷A1R和A2AR表達水平均較正常HSC明顯增強，腺苷A1R和A2AR共同參與調(diào)控酒精性肝纖維化中HSC的活化增殖，腺苷A1R和A2AR拮抗劑對酒精性肝纖維化中HSC活化增殖均具有顯著的抑制作用，但二者對cAMP-PKA-CREB信號通路具有相反的調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R965

【參考文獻】

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