本文關(guān)鍵詞： 非小細(xì)胞肺癌 A549細(xì)胞 多西他賽 白蛋白納米粒 聚乙二醇　出處：《延邊大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：近年來(lái),肺癌的發(fā)展十分迅速,全世界范圍內(nèi)每年有超過(guò)100萬(wàn)的患者被診斷為肺癌,其發(fā)病率和死亡率在城市惡性腫瘤中高居第一,即使是在農(nóng)村也僅次于胃癌。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)占肺癌比例為75%～85%,而大于65歲的老年患者占1/2以上,由于NSCLC發(fā)現(xiàn)時(shí)絕大部分已經(jīng)處于晚期(III, IV期肺癌),其5年總生存率僅為12%-15%,因此許多患者失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。對(duì)于老年晚期NSCLC的治療方法,首選仍然是化學(xué)藥物治療,化療是對(duì)于無(wú)法接受手術(shù)的老年肺癌患者十分有效的治療方式,可以有效地減少肺癌的復(fù)發(fā)和延緩病情的進(jìn)展,提高臨床療效,延長(zhǎng)患者生存期并改善其生存質(zhì)量,但是由于老年患者生理代償能力較低,并且常合并各種慢性疾病,對(duì)于治療的耐受性較差,所以療效常常并不盡如人意。目前針對(duì)老年肺癌病人的化療藥物種類(lèi)和化療方案種類(lèi)繁多,如：順鉑、依托泊苷(VP-16)、拓?fù)涮婵�、吉西他濱、紫杉醇和多西紫杉醇等,但仍然缺乏一種成熟有效的治療方案,因此研制一種出效果良好和毒副作用小的藥物成為了抗腫瘤研究的焦點(diǎn)。多西他賽(docetaxel, DTX)是一種紫杉醇類(lèi)細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥,可作用于G2期和M期細(xì)胞,是目前較為新型的抗微管類(lèi)紫杉烷藥物,也是唯一得到美國(guó)食品藥品管理局(FDA)和歐盟批準(zhǔn)用于NSCLC一線和二線治療的化療藥物。根據(jù)許多臨床研究資料證明,多西他賽對(duì)于治療NSCLC是十分有效的。然而DTX的低水溶性仍是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題,這也嚴(yán)重限制了其在臨床上的應(yīng)用。目前的上市DTX藥物中如帕多菲和艾素中,吐溫80作為溶劑被應(yīng)用于解決其難溶性問(wèn)題,但是這常常會(huì)導(dǎo)致一些令患者難以忍受的副作用,如周?chē)窠?jīng)病變,溶血反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)等這些對(duì)人體正常組織器官的非特異性毒性作用。另外,這兩種市售藥物由于半衰期較短,因此患者需要頻繁地接受注射,極大地加重了患者的痛苦及不便,所以如何解決上述問(wèn)題成為了DTX藥物研究的焦點(diǎn)。在過(guò)去的幾十年中,可生物降解白蛋白納米粒在腫瘤靶向治療領(lǐng)域中受到了越來(lái)越多的關(guān)注。根據(jù)已有的研究報(bào)道可知,納米載藥系統(tǒng)可以通過(guò)透過(guò)性增強(qiáng)和滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng))使藥物更有效地聚集在腫瘤組織,從而實(shí)現(xiàn)藥物的靶向性；此外,納米載藥系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是它的半衰期很長(zhǎng),這使它比其它藥物擁有更強(qiáng)的緩釋性和長(zhǎng)效性。聚乙二醇(PEG)的分子式為H(CH2CH2O)nOH,其分子結(jié)構(gòu)由環(huán)氧乙烷聚合而成,理化性質(zhì)具有pH中性,水溶性和親水性高等特點(diǎn)。PEG具有以下優(yōu)點(diǎn)：無(wú)毒,無(wú)免疫原性,良好的生物相容性,能夠與多數(shù)蛋白多肽類(lèi)、小分子藥物以及脂質(zhì)體等通過(guò)不同的共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵進(jìn)行偶聯(lián),改變藥物的分子結(jié)構(gòu),從而改進(jìn)藥物的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)的性質(zhì),是FDA批準(zhǔn)的極少數(shù)可以作為體內(nèi)注射用藥的合成聚合物之一由于PEG化的這些優(yōu)勢(shì),對(duì)藥物進(jìn)行PEG化修飾越來(lái)越受歡迎。PEG化藥物具有許多優(yōu)點(diǎn),如：(1)延長(zhǎng)藥物半衰期,長(zhǎng)效緩釋作用；(2)改善難溶性藥物的溶解性：(3)降低藥物的免疫原性和抗原性,增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性；(4)減少酶降解作用；(5)增強(qiáng)藥物的靶向作用；(6)降低某些藥物的毒性�；谝陨衔覀兠枋龅陌椎鞍准{米粒和PEG化制劑明顯優(yōu)勢(shì),在本實(shí)驗(yàn)中,我們選擇乳化揮發(fā)交聯(lián)法制備了多西他賽白蛋白納米粒(docetaxel albuminnanoparticles, DANPs)和PEG化多西他賽白蛋白納米粒(docetaxel loaded PEG-albumin nanoparticles, PEG-DANPs)。然后我們研究了DANPs和PEG-DANPs的表征,并進(jìn)行了體外方面的一系列研究,包括：體外溶血反應(yīng)、體外釋放及其對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和攝取的情況；在體內(nèi)方面,我們分別建立了人非小細(xì)胞肺癌移植瘤及原位癌模型,分別研究了Aisu(?)、DANPs和PEG-DANPs三種藥物對(duì)移植瘤模型瘤塊抑制及體重減輕情況及藥物對(duì)原位癌裸鼠的抗瘤及抗轉(zhuǎn)移等情況,結(jié)果證明,PEG-DANPs對(duì)于NSCLC是一種十分安全、有效的治療藥物制劑。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：1.乳化揮發(fā)交聯(lián)法制備PEG化多西他賽白蛋白納米粒(PEG-DANPs)DTX原料藥溶于氯仿和乙醇中,白蛋白溶于無(wú)菌水中,將兩者混合后移至高壓乳均機(jī)內(nèi),20000 psi下進(jìn)行乳化12個(gè)循環(huán),將所得的溶液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)使氯仿迅速除去,最終得到具有藍(lán)色乳光的半透明狀分散液,經(jīng)冷凍干燥機(jī)凍干,復(fù)溶后過(guò)0.22μm膜,制成DANPs。DANPs溶于硼酸緩沖液,再加入mPEG(20000 kDa),在室溫下于攪拌儀中反應(yīng)3h,最后加入甘氨酸(11mg/mL)終止反應(yīng)。將反應(yīng)物移至70 kDa透析膜中旋轉(zhuǎn)過(guò)濾半小時(shí)后冷凍,合成物干燥備用。復(fù)溶后DANPs和PEG-DANPs用碘染色及考馬斯藍(lán)染色,進(jìn)行PAGE膠電泳,結(jié)果顯示PEG-DANPs合成成功。2.動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定DANPs和PEG-DANPs的粒徑和電位DANPs及PEG-DANPs凍干劑復(fù)溶,利用Malvern Nano ZS激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑及電位。DANPs粒徑為163.4±3.76 nm, zeta電位平均為-19.4±0.18 mV；PEG-DANPs粒徑為169.19±2.36 nm, zeta電位平均為-18.2±0.21 mV,說(shuō)明兩種納米顆粒大小合適,電位合理。3. Hitachi H-7650電子顯微觀察DANPs和PEG-DANPs的形態(tài)DANPs及PEG-DANPs凍干劑復(fù)溶,取10μL滴在蠟塊表面,另取表面膜化處理的銅網(wǎng)正面朝下覆于液滴上,放置10 min后取下銅網(wǎng),用濾紙吸干銅網(wǎng)表面液體,取1%磷鎢酸溶液負(fù)染色10 mmin,取下銅網(wǎng)置于燈下烤十,透射電鏡下觀祭載藥納米粒的顯微形態(tài)。在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)DANPs及PEG-DANPs顆粒大小均勻,形狀接近規(guī)則的圓球形。4.高效液相色譜法和(HPLC)和高速離心法測(cè)定DANPs和PEG-DANPs的載藥量和包封率DANPs及PEG-DANPs凍干劑加入適量的乙腈復(fù)溶,采用HPLC法測(cè)定DANPs及PEG-DANPs中的藥物含量。DANPs的包封率為93.58±0.86%,載藥量為8.71±0.98%;PEG-DANPs的包封率為95.4±5.5%,載藥量為8.72±1.05%。5.藥物體外釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)三種藥物及制劑的釋放特點(diǎn)Aisu(?)、DANPs及PEG-DANPs分別配置成5 mg/mL的溶液,加入孔徑為10kD的透析袋中,兩端扎緊后將透析袋置于40 mLPBS緩沖液中恒溫振蕩。在一系列時(shí)間點(diǎn)取出樣品0.2 mL透析液,同時(shí)補(bǔ)充0.2 mL透析液,在透析完成后將透析袋剪破,攪拌均勻,作為時(shí)間無(wú)窮大時(shí)的藥物釋放量。使用HPLC法測(cè)定濃度,分別繪制出三種體外藥物釋放曲線。根據(jù)所繪體外釋放曲線所示,Aisu(?)在2小時(shí)時(shí)已經(jīng)基本完全釋放,而DANPs和PEG-DANPs兩種制劑釋放均比較平緩,無(wú)突釋現(xiàn)象,反映出藥物白蛋白納米粒的穩(wěn)定性以及釋放的緩釋性。另外,PEG-DANPs較DANPs的釋放更加平緩,在血漿中的滯留時(shí)間更長(zhǎng),緩釋效應(yīng)更加突出。6.藥物體外溶血實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)三種藥物及制劑對(duì)機(jī)體紅細(xì)胞的破壞情況取新鮮豚鼠血除去纖維蛋白后,加0.9%生理鹽水離心洗滌直至上清液不再顯示紅色為止,加入5%葡萄糖注射液配制成2%(v/v)的紅細(xì)胞混懸液。取Aisu(?), DANPs以及PEG-DANPs制劑；另取同體積新鮮蒸餾水作為陽(yáng)性對(duì)照組；取同體積5%葡萄糖注射液作為陰性對(duì)照組,向上述各管中分別加入同體積的2%紅細(xì)胞混懸液,置37℃的水浴1h后取出試管以2000 rpm離心5 min,吸取上清液在576 nm處測(cè)定各管溶液的吸收度計(jì)算各試驗(yàn)管樣品的溶血度值。結(jié)果顯示,與Aisu(?)和DANPs進(jìn)行比較,在不同濃度下,PEG-DANPs的溶血程度均有所下降,提示其對(duì)機(jī)體紅細(xì)胞的破壞作用最小。7.三種藥物及制劑體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究12只健康雄性豚鼠隨機(jī)分為3組,每組4只,分別尾靜脈注射Aisu(?)、DANPs和PEG-DANPs (20mg/kg)。于特定時(shí)間點(diǎn)各取血0.5 mL,置于肝素化的離心管中,離心(4000 rpm,10min),分離血漿,放入-20℃冰箱避光保存,利用HPLC測(cè)定并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示,PEG-DANPs與Aisu(?)及DANPs組比較,在t 1/2、AUC、Cl均有顯著性差異,說(shuō)明PEG-DANPs較Aisu(?)及DANPs在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng),具有更長(zhǎng)的生物半衰期和體內(nèi)滯留時(shí)間。8.MTT法測(cè)定三種藥物及制劑對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制情況A549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,以8×103個(gè)/孔加入96孔板,培育24h后,分別加入PBS液(陰性對(duì)照組)、Aisu(?)、DANPs、PEG-DANPs,藥物濃度依次為0μg/mL、 0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h及72h。吸棄舊培養(yǎng)基后加入20μL MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí),再加入二甲基亞砜(DMSO)溶液,低速振蕩10 min,測(cè)定在490 nm處的吸光度值,記錄結(jié)果,計(jì)算不同藥物濃度下細(xì)胞增殖抑制率并軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示,三種藥物都對(duì)A549細(xì)胞表現(xiàn)出相同的濃度-時(shí)間依賴(lài)型細(xì)胞毒性。在高濃度(1-100μg/mL)時(shí),Aisu(?)制劑比DANPs和PEG-DANP納米粒制劑抑制癌細(xì)胞增殖的能力更強(qiáng)；而在正常和低濃度區(qū)間(0.001-0.1μg/mL)時(shí),納米粒制劑對(duì)于對(duì)于癌細(xì)胞增殖的抑制要高于Aisu(?)在72小時(shí),Aisu(?)制劑由于在血液中已經(jīng)幾乎檢查不到血藥濃度,因此,對(duì)細(xì)胞的抑制率也幾乎難以測(cè)出。9.流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定三種藥物及制劑對(duì)A549細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549腫瘤細(xì)胞,以1×105個(gè)/瓶傳代培養(yǎng)至4個(gè)25cm3培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)生長(zhǎng)至密度60%時(shí)加入對(duì)照組(空白培養(yǎng)基)、Aisu(?)、DANPs和PEG-DANPs進(jìn)行干預(yù),收集各組細(xì)胞,加Buffer結(jié)合液混勻,吹打均勻。室溫避光操作,加FITC混勻后,再加PI,室溫避光反應(yīng)30min。立即上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)結(jié)果可知,隨著對(duì)照組、Aisu(?)、DANPs和PEG-DANPs藥物的不同,在48小時(shí)這個(gè)特定時(shí)間點(diǎn)上,右上象限(An+PI+)及右下象限(An+PI-)之和,即早凋、晚凋細(xì)胞和壞死細(xì)胞所占比例逐漸增多,分別為2.86%、25.85%、45.00%及50.65%,提示用藥組比對(duì)照組均能更顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而在三者之間,PEG-DANPs較DANPs及Aisu(?)更能夠誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡,即PEG-DANPs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力是最強(qiáng)的。10.激光共聚焦顯微鏡觀察DANPs和PEG-DANPs入胞情況收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于鋪有細(xì)胞爬片的6孔板內(nèi),培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,加入已制備好的DANPs和PEG-DANPs,將6孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在達(dá)到特定時(shí)間點(diǎn)時(shí),用鑷子將細(xì)胞爬片取出,用冷PBS緩沖溶液清洗3次后放在4%的多聚甲醛中固定。然后取出爬片倒置在載玻片上,用50%的甘油封片。在488 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光條件下,用共聚焦顯微鏡觀察。香豆素6在488nm激光激發(fā)下顯綠色熒光,比較它們之間的鏡下情況,隨著制劑的不同,熒光攝取強(qiáng)度也逐漸增大,結(jié)果顯示PEG-DANPs比DANPs更容易進(jìn)入A549細(xì)胞內(nèi)。11.非小細(xì)胞肺癌移植瘤及原位癌模型建立并評(píng)價(jià)藥物及制劑的抗瘤效率及毒性BALB/c裸鼠40只,20只用于建立皮下移植瘤模型,20只用于建立原位癌模型,均分為4組,待接種后13天(即皮下組腫瘤體積到達(dá)120 mm3時(shí)),兩組給予葡萄糖注射液,Aisu(?)、DANPs和PEG-DANPs,均通過(guò)尾靜脈注射(20mg/kg),每7天給藥1次,共給藥4次。在最后一次給藥治療2天后,將皮下移植瘤組和原位癌組所有裸鼠全部處死,取瘤塊、肺臟、心臟、肝臟、脾臟、腎臟,以10%中性甲醛緩沖液固定,之后送檢HE染色切片。根據(jù)裸鼠瘤塊體積與藥物治療時(shí)間關(guān)系曲線我們發(fā)現(xiàn),Aisu(?)、DANPs組和PEG-DANPs組三種制劑對(duì)腫瘤都具有一定的抑制作用,PEG-DANPs組對(duì)瘤塊增殖的抑制作用最強(qiáng)。Aisu(?)組、DANPs組和PEG-DANPs組裸鼠的體重均有不同程度的下降,說(shuō)明三種制劑對(duì)機(jī)體都有一定的系統(tǒng)毒性,但其中PEG-DANPs下降得最小,表明PEG-DANPs組對(duì)機(jī)體的毒性則最小。根據(jù)病理結(jié)果顯示,PEG-DANPs能夠更好地抑制移植瘤及原位癌,并且能夠更加有效地抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。12.觀察經(jīng)藥物治療后裸鼠生存率情況選取裸鼠32只,建立皮下移植瘤模型,分成陰性對(duì)照組(葡萄糖注射液組),陽(yáng)性對(duì)照組(Aisu(?)), DANPs組和PEG-DANPs組,持續(xù)治療裸鼠直至裸鼠自然死亡,觀察經(jīng)不同藥物及制劑治療后裸鼠的生存率,待全部裸鼠死亡后,統(tǒng)計(jì)并繪制裸鼠生存率曲線。結(jié)果顯示,由PEG-DANPs治療的裸鼠比其他組可以存活更長(zhǎng)的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)論1.成功地構(gòu)建了PEG化多西他賽白蛋白納米粒；2. PEG-DANPs粒徑合適,分布均勻穩(wěn)定,載藥量及包封率良好,具有明顯的緩釋效應(yīng),對(duì)機(jī)體紅細(xì)胞有較低的破壞作用；3. PEG-DANPs能夠更好地進(jìn)入A549細(xì)胞,能夠有效地抑制A549細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡：4. PEG-DANPs能夠有效地抑制非小細(xì)胞肺癌移植瘤及原位癌的生長(zhǎng)并且對(duì)機(jī)體具有較小的毒性作用,能夠有效地控制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,能較明顯地延長(zhǎng)裸鼠的生存時(shí)間。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R943;R96

【參考文獻(xiàn)】

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