本文關(guān)鍵詞： 丹參酮ⅡA 特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化 上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化 TGF-β/Smad 小窩蛋白-1　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)嚴(yán)重威脅人類健康和生命,是最難治的慢性纖維化性肺部疾病,其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢,死亡率高。但因發(fā)病機(jī)制至今仍不明確,目前尚無有效的治療方法。2011指南指出肺移植是目前唯一有效的治療辦法,尚沒發(fā)現(xiàn)哪種藥物對IPF有效,研究提示某些藥物對IPF患者可能有益。因此,繼續(xù)尋找有效的治療IPF的藥物仍是目前研究之重。丹參是一種經(jīng)典傳統(tǒng)中藥,對活血化淤有效,從丹參中提取的脂溶性活性成分之一丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA)是目前研究較多的一種單體成分,主要因?yàn)榈⑼駻是眾多丹參酮成分中最為穩(wěn)定的有效活性成分,且其含量最高,分子結(jié)構(gòu)明確,具有丹參的大部分藥物效應(yīng),在臨床上常用于心血管病的治療。近來大量研究表明丹參酮ⅡA作用很多,包括清除氧自由基、抗炎,抗腫瘤等多種藥學(xué)活性及多種臟器保護(hù)作用。肺泡巨噬細(xì)胞過度浸潤與肺纖維化的異常炎癥反應(yīng)有關(guān),先前的研究不僅發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA抑制博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺組織炎癥反應(yīng),而且可以減輕肺纖維化。因此,我們首先用博來霉素建立肺纖維化大鼠模型,進(jìn)一步驗(yàn)證丹參酮ⅡA抑制纖維化肺組織炎癥反應(yīng)的作用,發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可使肺泡巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68表達(dá)下降。同時從形態(tài)學(xué)角度證實(shí)丹參酮ⅡA可以減輕肺纖維化,抑制膠原沉積。最新的研究認(rèn)為,肺泡上皮損傷和病理性損傷修復(fù)在IPF發(fā)生發(fā)展中起重要作用,具體表現(xiàn)在以下幾個方面:肺泡上皮損傷;上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithlial to mesenchymal transition,EMT);纖維細(xì)胞灶形成;端粒受損變短等,其中有研究報(bào)道,EMT是成纖維細(xì)胞的主要來源之一,主要表現(xiàn)細(xì)胞黏附分子中的E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)缺失,上皮細(xì)胞標(biāo)志物下調(diào),間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物中的波形蛋白(Vimentin)、纖維連接蛋白(Fibronetin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達(dá)上調(diào),細(xì)胞極性消失,類似成纖維細(xì)胞形態(tài)。越來越多的證據(jù)表明EMT發(fā)生與肺纖維化進(jìn)展密切相關(guān),是目前研究熱點(diǎn)內(nèi)容。FU等發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA阻斷MCF-7和HCC1973乳腺癌細(xì)胞系EMT的發(fā)生。Wang等也報(bào)道丹參酮ⅡA抑制EMT及體內(nèi)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移。這兩個實(shí)驗(yàn)證明丹參酮ⅡA在乳腺癌及肝癌中的EMT的發(fā)生有抑制作用。我們前期工作發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA有抑制肺纖維化的作用,因此,猜測丹參酮ⅡA有可能是通過抑制EMT而減輕肺纖維化,然而,關(guān)于丹參酮ⅡA對纖維化肺疾病EMT作用的細(xì)胞及分子機(jī)制的研究很少。我們預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明博來霉素誘導(dǎo)的纖維化肺組織E-cadherin表達(dá)減少,而Fibronectin和Vimnetin表達(dá)增加,經(jīng)過丹參酮ⅡA預(yù)處理組上述因子變化被逆轉(zhuǎn),證明丹參酮ⅡA可以抑制EMT發(fā)生。因此將對其進(jìn)行深入研究。轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)是一種細(xì)胞因子,功能較多,主要通過影響細(xì)胞的增生、分化、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)生成來調(diào)節(jié)組織的形態(tài)發(fā)生及分化,被公認(rèn)為最重要的促纖維化因子,是各種纖維化中EMT的主要觸發(fā)因素,其中包括腎小管上皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞EMT等。參與肺纖維化EMT的信號通路有很多,其中TGF-β/Smad是最經(jīng)典的一種信號通路,Smad是TGF-β的下游因子,研究證明,TGF-β能誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,主要是通過活化了的Smad2/3,促進(jìn)肺纖維化形成。有學(xué)者研究丹參酮IIA抑制腎間質(zhì)纖維化的作用,發(fā)現(xiàn)在腎臟成纖維細(xì)胞中,丹參酮IIA主要通過抑制TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用;最近的研究展示丹參酮ⅡA可以顯著減少博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的炎癥反應(yīng)及減少大鼠肺組織TGF-β1的表達(dá)。但是,丹參酮ⅡA對TGF-β信號依賴的EMT發(fā)生及對肺纖維化疾病潛在機(jī)制的作用還不是很清楚,因此,我們的研究假設(shè)丹參酮ⅡA能調(diào)整IPF的發(fā)生過程中TGF-β相關(guān)的EMT過程,從體內(nèi)體外兩個方面研究其潛在的分子機(jī)制。小窩蛋白-1(Caveolin-1)具有維持小窩形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的作用,是小窩的標(biāo)志性蛋白。其中腳手架結(jié)構(gòu)域(Caveolin scaffolding domain,CSD)是Caveolin-1與胞內(nèi)其他信號分子相互作用的區(qū)域,為多種信號分子的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。Caveolin-1在多數(shù)分化細(xì)胞中表達(dá)豐富,其中包括肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。近幾年,一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn):IPF患者及博來霉素誘導(dǎo)大鼠肺組織中存在著Caveolin-1的表達(dá)下調(diào);Caveolin-1基因敲除小鼠,Caveolin-1表達(dá)明顯下降,肺部出現(xiàn)類似肺纖維化病變,Kasper等發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGF-β1處理后的肺組織,上皮細(xì)胞中Caveolin-1的表達(dá)明顯下降,以上研究均提示Caveolin-1參與了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。又因Caveolin-1負(fù)性調(diào)節(jié)多種信號通路發(fā)揮作用,其中TGF-β/Smad信號通路研究較多。已有文獻(xiàn)報(bào)道,Caveolin-1與TGF-β1Ⅰ型、TGF-βⅡ型受體及Smad2等共同定位在細(xì)胞質(zhì)膜豐富的區(qū)域,Caveolin-1通過CSD與TGF-β1Ⅰ型受體及TGF-βⅡ型受體作用,負(fù)性調(diào)節(jié)TGF-β與受體結(jié)合,阻斷TGF-β/Smad信號通路。我們通過對丹參酮ⅡA抑制TGF-β依賴的EMT過程的體內(nèi)體外研究,發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺巨噬細(xì)胞增加、膠原沉積、EMT過程及TGF-β/Smad信號通路的激活。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)丹參酮ⅡA抑制A549細(xì)胞中TGF-β信號通路以及EMT,但是丹參酮ⅡA是通過哪些途徑起到這樣的作用尚不清楚,Caveolin-1是TGF-β信號通路的上游因子,在肺纖維化過程中,Caveolin-1的表達(dá)下降;增加Caveolin-1的表達(dá)可以抑制TGF-β信號通路,達(dá)到一定程度抑制肺纖維化的目的,因此,既然Caveolin-1和丹參酮ⅡA都有抑制TGF-β信號通路的作用,我們是否可以猜想丹參酮ⅡA抑制肺纖維化的作用可能與Caveolin-1有關(guān)呢?我們主要通過體外實(shí)驗(yàn)研究丹參酮ⅡA是否通過Caveolin-1調(diào)控下游的TGF-β/Smad信號通路介導(dǎo)的EMT過程,從而達(dá)到抑制肺纖維化目的?為臨床新藥開發(fā)提供更多的理論基礎(chǔ)。第一部分丹參酮ⅡA抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化目的:探討丹參酮ⅡA對肺纖維化大鼠的肺組織形態(tài)學(xué)變化及Ⅰ型膠原、羥脯氨酸含量、CD68表達(dá)的影響,以明確丹參酮ⅡA對肺間質(zhì)纖維化有無保護(hù)作用。方法:清潔級SD大鼠,體重約250g,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(Control),丹參酮ⅡA組(TanⅡA),纖維化組(BLM),丹參酮ⅡA+纖維化(BLM+TanⅡA),每組6只。各組干預(yù)28天,處死所有大鼠,取肺組織,計(jì)算肺組織的濕/干重比,對肺組織進(jìn)行石蠟包埋后行組織病理學(xué)檢測及ELISA檢測各組大鼠肺組織中的Ⅰ型膠原及羥脯氨酸含量,通過免疫組織化學(xué)方法檢測肺巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的表達(dá)。結(jié)果:丹參酮ⅡA+纖維化組的大鼠肺濕/干重比明顯低于纖維化組;HE染色可見丹參酮ⅡA+纖維化組與纖維化組比較肺泡間隔纖維增生灶較少,累及病變范圍較小,肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞較少,Masson染色提示膠原纖維減少;纖維化組Ⅰ型膠原及羥脯氨酸含量、CD68表達(dá)與對照組比較明顯升高,丹參酮ⅡA+纖維化組與纖維化組比較Ⅰ型膠原及羥脯氨酸含量、CD68表達(dá)下降。結(jié)論:丹參酮ⅡA抑制博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺組織肺泡巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68表達(dá),減輕炎癥反應(yīng);丹參酮ⅡA抑制Ⅰ型膠原及羥脯氨酸含量,減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積,減輕肺纖維化。第二部分丹參酮ⅡA抑制TGF-β依賴的EMT機(jī)制研究目的:研究丹參酮ⅡA對博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠肺組織及TGF-β1刺激的A549細(xì)胞EMT生成及TGF-β/Smad通路的影響,進(jìn)一步探討丹參酮ⅡA改善肺間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為對照組(Control),丹參酮ⅡA組(TanⅡA),纖維化組(BLM),丹參酮ⅡA+纖維化組(BLM+TanⅡA),每組6只。各組干預(yù)28天,處死所有大鼠,取肺組織;體外實(shí)驗(yàn)分為4組:對照組(Control):10μM的DMSO;丹參酮ⅡA組(TanⅡA):10μM的丹參酮ⅡA;TGF-β1組(TGF-β1):10μM的DMSO+10ng/ml的TGF-β1;丹參酮ⅡA+TGF-β1(TGF-β1+TanⅡA):10μM的丹參酮ⅡA+10ng/ml的TGF-β1。通過免疫熒光方法檢測各組大鼠肺組織及各組細(xì)胞E-cadherin的表達(dá);Real-time PCR檢測各組大鼠肺組織TGF-β1RNA水平的表達(dá);Western blotting檢測各組大鼠肺組織及各組細(xì)胞TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、E-cadherin、α-SMA、Fibronectin和Vimentin蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果:免疫熒光染色檢測結(jié)果提示纖維化組與對照組及丹參酮ⅡA組比較,E-cadherin的陽性染色減少,丹參酮ⅡA預(yù)處理后E-cadherin的表達(dá)被部分恢復(fù);Western blotting及Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維化組、TGF-β1組分別與對照組比較,E-cadherin表達(dá)明顯下降,α-SMA、Fibronectin和Vimentin蛋白表達(dá)明顯升高,TGF-β1RNA及蛋白表達(dá)、p-Smad2、p-Smad3表達(dá)均升高,加入丹參酮ⅡA干預(yù)性治療組上述因子表達(dá)均被逆轉(zhuǎn),差異有顯著性。而且丹參酮ⅡA對Smad2、Smad3的表達(dá)無影響,僅能影響Smad2、Smad3的磷酸化水平。結(jié)論:丹參酮ⅡA通過抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺組織EMT及TGF-β/Smad信號通路的激活,減輕肺纖維化;丹參酮ⅡA抑制TGF-β1刺激的A549細(xì)胞TGF-β信號依賴的EMT形成。第三部分丹參酮ⅡA通過上調(diào)Caveolin-1抑制TGF-β1刺激的A549細(xì)胞EMT目的:進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)探討丹參酮ⅡA是否通過Caveolin-1調(diào)控下游TGF-β/Smad信號通路及EMT過程,為丹參酮ⅡA應(yīng)用于臨床,開發(fā)新藥提供更多的理論基礎(chǔ)。方法:我們首先用Western blotting檢測第二部分四組細(xì)胞Caveolin-1蛋白水平表達(dá)。然后構(gòu)建并篩選了轉(zhuǎn)染效率高的Caveolin-1特異性sh RNA表達(dá)載體用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染,共分為7組:對照組(A);丹參酮ⅡA組(B):10μM的丹參酮ⅡA處理2h;Caveolin-1 sh RNA+丹參酮ⅡA(C):轉(zhuǎn)染Caveolin-1 sh RNA 24h,然后用10μM的丹參酮ⅡA處理2h;TGF-β1(D):10ng/ml的TGF-β1處理48h;Caveolin-1sh RNA+TGF-β1(E):轉(zhuǎn)染Caveolin-1 sh RNA 24h,然后用10ng/ml的TGF-β1處理48h;丹參酮ⅡA+TGF-β1(F):10μM的丹參酮ⅡA處理2h,然后用10ng/ml的TGF-β1處理48h;Caveolin-1 sh RNA+丹參酮ⅡA+TGF-β1(G):轉(zhuǎn)染Caveolin-1sh RNA 24h,然后用10μM的丹參酮ⅡA處理2h,再用10ng/ml的TGF-β1處理48h。RT-PCR及Western blotting檢測各組細(xì)胞TGF-β1、E-cadherin、Fibronectin和Vimentin RNA及蛋白水平表達(dá)。Western blotting檢測各組細(xì)胞p-Smad2、p-Smad3表達(dá)。結(jié)果:TGF-β1組與對照組及丹參酮ⅡA組比較Caveolin-1的表達(dá)水平明顯下降,經(jīng)過丹參酮ⅡA預(yù)處理后Caveolin-1的表達(dá)明顯升高,說明丹參酮ⅡA在纖維化過程中影響了Caveolin-1的表達(dá);RT-PCR及Western blotting均提示丹參酮ⅡA(B組)與對照組(A組)比較TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、E-cadherin、Fibronectin、Vimentin的表達(dá)變化不明顯,但轉(zhuǎn)染Caveolin-1sh RNA(C組)后,TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表達(dá)升高,上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下降,而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Fibronectin與Vimentin表達(dá)升高;A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染Caveolin-1 sh RNA 24 h后,10 ng/ml TGF-β1處理細(xì)胞48 h(E組)與僅接受TGF-β1處理48 h(D組)比較,Caveolin-1 sh RNA+丹參酮ⅡA+TGF-β1(G組)與丹參酮ⅡA+TGF-β1(F組)比較,TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表達(dá)升高,E-cadherin的表達(dá)明顯下降,Fibronectin與Vimentin的表達(dá)升高,而經(jīng)過丹參酮ⅡA治療后上述因子的表達(dá)均被逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:丹參酮ⅡA增加了TGF-β1刺激的A549細(xì)胞Caveolin-1的表達(dá);丹參酮ⅡA通過上調(diào)Caveolin-1抑制TGF-β1刺激的A549細(xì)胞TGF-β信號依賴的EMT。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R965

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