本文關鍵詞：植物源重組人血清白蛋白的殘留宿主雜質研究　出處：《武漢大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：人血清白蛋白是血漿中含量最大的一種蛋白,含量達到40-50g/L,對維持體內滲透壓具有重要的作用,此外它還有運輸脂類、激素、藥物等重要功能。白蛋白已被廣泛應用于燒傷、肝腹水和低白蛋白癥等的臨床治療,另外白蛋白還被用于藥物的賦形劑,穩(wěn)定劑,以及細胞培養(yǎng)的添加劑量。由于極其廣泛的應用,人源血清白蛋白已不能滿足現(xiàn)在的市場需求。實驗室利用水稻種子這一新型的表達體系表達重組人血清白蛋白,并實現(xiàn)經濟有效的大規(guī)模生產。臨床應用中,通常人血清白蛋白的使用劑量為每人每次10-20g,因此,在利用水稻種子生產重組人血清白蛋白時,急需對其宿主雜質的安全性進行相關評估,并對其進行有效的質量控制。宿主雜質中,宿主蛋白和宿主DNA是最主要的兩個宿主雜質,也是重組蛋白藥質量控制中最為關注的要素。歐洲藥品審評署(EMEA)明確指出,所有生物制品都需要對這兩種宿主雜質進行詳細的說明以確保最終產品的臨床應用安全性。本論文的主要結果如下： 1.殘留宿主DNA定量方法的建立：試驗通過定量PCR的方法,以水稻5S核糖體基因為內參擴增序列,建立水稻宿主殘留DNA定量方法。實驗比較了兩個常用的定量PCR體系,SYBRGreen Ⅰ熒光染料和Taqman探針法,在沒有明顯差異的情況下,基于成本考慮,選擇SYBRGreen Ⅰ熒光染料為最終的定量體系。通過引物的選擇,引物濃度的優(yōu)化,最終建立的定量方法具有高度的線性相關性,相關系數(shù)R2達到0.9991,擴增效率接近100%,檢測區(qū)間為2×104pg到0.2pg每個反應體系,最低定量限度為0.2pg每個反應體系。qPCR具有很好的重復性與特異性,回收實驗的回收率在80%到122.2%之間,且標準樣品的選擇不會對結果有明顯的影響。對一個重組人血清白蛋白典型樣品的定量分析,最終樣品的宿主殘留DNA為每劑量(10g)含3.5ng,少于法規(guī)每劑量10ng的要求。 2.殘留宿主蛋白定量方法的建立：利用水稻種子抗原制備抗體建立夾心ELISA定量檢測方法,制備的抗體具有很好的覆蓋性且不對目的蛋白白蛋白有交叉反應,實驗比較了分別以HRP標記抗體為檢測抗體和Biotin標記抗體為檢測抗體的靈敏度,最后選擇靈敏度較高的Biotin標記抗體為檢測抗體的反應體系。實驗主要通過包被抗體和檢測抗體的濃度優(yōu)化,建立的ELISA定量方法具有良好的非線性相關性,相關系數(shù)R2達到0.99,定量區(qū)間從25ng/ml到1.25ng/ml之間,最低定量限為1.25ng/ml。ELISA具有很好的重復性及精確度,定量結果的cv值小于11.5%,添加回收試驗中宿主蛋白的回收率在86%到110.6%之間,樣品的最終定量純度達到99.9998%。 3.殘留宿主蛋白的鑒定研究：為了避免目的產物人血清白蛋白對殘留宿主蛋白鑒定的干擾,實驗設計抗體免疫層析的方法去除目的蛋白-重組人血清白蛋白,并達到濃縮殘留宿主蛋白的效果。實驗通過人源血清白蛋白免疫兔子制備抗人血清白蛋白多克隆抗體,用制備的人血清白蛋白抗體與CNBr-activatived SepharoseTM4Fast Flow進行偶聯(lián),獲得能夠吸附約100mg人血清白蛋白的抗體免疫層析柱。利用該層析柱分離目的蛋白(重組人血清白蛋白)和殘留宿主蛋白。實驗建立的方法對99.8%樣品的宿主蛋白回收率高于90%。收集的殘留宿主蛋白經過label free NanoLC-ESI-MS/MS鑒定分析,結果顯示,幾乎所有的殘留宿主蛋白都能被有效鑒定。 4.殘留宿主蛋白反復給藥的毒性研究：實驗收集99.9%純度產品中的白蛋白宿主蛋白,以1倍(0.2mg/kg)、5倍(1mg/kg)、25倍(5mg/kg)的劑量進行28天的反復靜脈注射大鼠的毒性試驗。整個試驗過程中,大鼠沒有出現(xiàn)樣品相關的致命性毒性引起的死亡現(xiàn)象,主要的毒性表現(xiàn)為貧血癥狀以及脾功能亢進,初步推測與低滲性溶血或免疫性溶血有關。
[Abstract]:Human serum albumin is a protein content in the plasma of the largest content reached 40-50g/L, to maintain the osmotic pressure plays an important role, in addition it has important function in transport of lipids, hormones, drugs and so on. Albumin has been widely used in clinical treatment of burns, liver ascites and low serum albumin in addition, albumin is also used to pharmaceutical excipients, stabilizer, dosage and cell culture. Because of widespread application, human serum albumin has been unable to meet the current market demand. This new type of rice seed expression system of recombinant human serum albumin expression in the laboratory, and realize large-scale production effectively. The clinical application of human serum albumin, usually dose for each time 10-20g, therefore, in the use of rice seed production of recombinant human serum albumin, the safety need of its host of impurities The relevant assessment, and effectively control the quality of the host. Impurities, host proteins and host host DNA is the two main impurity, is the most concerned factor recombinant protein drug quality control. The European Medicines Evaluation Agency (EMEA) clearly pointed out that all biological products are required for the detailed explanation of this two host impurity to ensure the clinical safety of the final product. The main results of this thesis are as follows:
The establishment of 1. residual host DNA quantitative method: Test methods used by PCR, a rice 5S gene as internal ribosome sequences, establish DNA quantitative method of residue in rice host. The experimental comparison of two commonly used quantitative PCR system, SYBRGreen 1 and Taqman fluorescent probe method, no obvious differences in the situation, based on the cost consider, choose SYBRGreen I dye for quantitative system finally. Through the selection of the primers, optimized primer concentration, quantitative method established has a high linear correlation, the correlation coefficient reached 0.9991 R2, expanding the efficiency rate close to 100%, the detection range of 2 * 104pg to 0.2pg each reaction system, the minimum limit for each quantitative 0.2pg.QPCR reaction system has good repeatability and specificity, recovery experiments at the rate of 80% to 122.2%, and the standard sample selection does not have obvious influence on the results The quantitative analysis of a typical sample of recombinant human serum albumin shows that the final residual DNA of the sample is 10g with 3.5ng, which is less than the requirement of 10NG per regulation.
The establishment of 2. quantitative methods: residual host protein antibody sandwich ELISA quantitative detection method established by antigen preparation of rice seed, antibody preparation has good coverage and not objective protein albumin cross reaction, were compared respectively with HRP labeled antibody as detection antibody and Biotin labeled antibody for the sensitivity of antibody detection and response the final choice of Biotin system with high sensitivity for the detection of antibody labeled antibody. The experiment of coating concentration optimization of antibody and detection antibody, ELISA method has good linear correlation, the correlation coefficient R2 is 0.99, the quantitative range from 25ng/ml to 1.25ng/ml, the limit of quantitation was 1.25ng/ml.ELISA has good repeatability and the accuracy of quantitative results of CV value is less than 11.5%, the recovery recovery test of host proteins at the rate of 86% to 110.6% between the samples. The final quantitative purity is 99.9998%.
The 3. residue identification of host proteins: to avoid interference to the product of human serum albumin on residual host protein identification methods, experimental design of antibody immune chromatography removal protein recombinant human serum albumin, and achieve the concentrated residual host protein effect. Through the experiment of human serum albumin preparation of rabbit polyclonal anti human serum albumin antibody preparation of human serum albumin antibody and CNBr-activatived SepharoseTM4Fast Flow were coupled to obtain antibody immune chromatography column to 100mg adsorption of human serum albumin. The target protein is separated using the chromatography column (recombinant human serum albumin) and residual host protein. The developed method in 99.8% samples of host protein recovery rate is higher than the residual host after the label free NanoLC-ESI-MS/MS protein identification and analysis, 90%. collected results show that almost all of the residual The host protein can be effectively identified.
4. residual host protein repeatedly to drug toxicity studies: collected 99.9% albumin host protein purity in the product, with 1 times (0.2mg/kg), 5 times (1mg/kg), 25 times (5mg/kg) toxicity tests were repeated dose intravenous injection of rats for 28 days. During the experiment, the rats did not appear the phenomenon of death caused fatal toxicity related to the sample, the main toxicity showed symptoms of anemia and hypersplenism, speculated and hypotonic hemolysis or immune hemolytic.

【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R977.6;Q946.1

【共引文獻】

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本文編號：1439101