本文關(guān)鍵詞：中藥血清藥理學(xué)、血清藥物化學(xué)研究進展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

中南藥學(xué) 2013年7月 第11卷 第7期　Central South Pharmacy. July 2013, Vol. 11 No. 7

綜述

中藥血清藥理學(xué)、血清藥物化學(xué)研究進展

安莉萍1，竇志華2*，候金燕1 （1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210046；2.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院藥劑科，江蘇 南

通 226006）

關(guān)鍵詞：中藥血清藥物化學(xué)；血清藥理學(xué)；血清指紋圖譜

中圖分類號：R96, R914　　　　文獻標識碼：A　　　　文章編號：1672-2981(2013)07-0521-04doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2013.07.012

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥研究的核心，也是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵，但由于中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性以及有效成分對機體作用的協(xié)同性，中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究十分困難，目前還沒有一種理想的研究方法，已成為制約中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展公認的瓶頸問題[1]。尋找適合中藥復(fù)雜體系的研究方法，闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，一直是中藥研究的關(guān)鍵科學(xué)問題，這已列入國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要、“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項和中醫(yī)藥創(chuàng)新發(fā)展規(guī)劃綱要相關(guān)領(lǐng)域和主題的重要內(nèi)容[2]。

現(xiàn)今國內(nèi)外中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的主流研究模式是化學(xué)分離后逐個進行活性測試或活性導(dǎo)向下的追蹤分離[3]，所確定的成分是否是藥效的代表性成分有待商榷[4]。首先，中藥是多成分、多靶點的復(fù)雜體系，所體現(xiàn)的治療效果也往往是多種成分作用于不同靶點的整合結(jié)果，這也是中藥的特色和優(yōu)勢[5]，采用傳統(tǒng)方法進行成分分離后，彼此的相互整合作用消失，割裂了中藥的整體性[6]。更重要的是，中藥傳統(tǒng)的口服給藥形式?jīng)Q定了只有被吸收進入體內(nèi)的物質(zhì)才能產(chǎn)生活性，且吸收進入體內(nèi)發(fā)揮作用的并非一定是原形成分，也可能是其代謝產(chǎn)物[7]，如大多數(shù)原生苷是前藥，其在人體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物發(fā)揮生物學(xué)作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)赤芍所含的芍藥苷在體內(nèi)代謝成芍藥苷代謝素-Ⅰ產(chǎn)生活性[9]，且芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化[10]。1 血清藥理學(xué)、血清藥物化學(xué)研究方法的提出

基于“含藥血清”的中藥效應(yīng)物質(zhì)研究策略首先由日本學(xué)者田代真一于20世紀80年代提出[11]，該策略包括“血清藥理學(xué)（Serum Pharmacology）”和“血清藥物化學(xué)（Serum Pharmacochemistry）”研究。所謂“含藥血清”是指給動物或人服用藥物后一定時間采血、分離的血清，該血清中含有原形藥物成分及其代謝產(chǎn)物，竇志華[12]所在的課題組將其統(tǒng)稱為“血中藥源性成分”；“血清藥理學(xué)”指將含藥血清作用于體外細胞模型進行藥效評價；“血清藥物化學(xué)”指采用現(xiàn)代分析方法對含藥血清中的藥源性成分進行定性定量分析。國內(nèi)有關(guān)含藥血清的報告始見于1994年，國家對此類研究非常重視并給予扶持，國家中醫(yī)藥管理局、國家自然科學(xué)基金先后列為重點研究項目[13-14]。

基金項目：江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項目（編號：08KJB360009）；江蘇省中醫(yī)藥局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項課題（編號：

HZ07071）；江蘇省藥學(xué)一施貴寶醫(yī)院藥學(xué)科研項目（編號：JS2012-04）。

雖然在吸收進入血液的直接物質(zhì)基礎(chǔ)中，并非所有的化學(xué)成分都為有效成分，但與中藥中的化學(xué)成分相比，因經(jīng)過胃腸道的處理、篩選和過濾，成分的種類和數(shù)目已大大減少，縮小了中藥藥理研究的靶向成分范圍，這樣大大簡化了中藥的復(fù)雜體系[15]。只對血中藥源性成分進行分離鑒定，不僅減少了工作量，且在其指導(dǎo)下對化合物進行活性導(dǎo)向分離，也降低了盲目性[16]。有關(guān)專家指出，基于體內(nèi)過程發(fā)現(xiàn)中藥效應(yīng)物質(zhì)是一個符合客觀實際的策略[8]。也有專家認為，中藥發(fā)揮作用的直接物質(zhì)存在于體內(nèi)，并且具有數(shù)目相對有限、能被現(xiàn)代分析儀器定性定量測定等特點[17]。因此，血清藥物化學(xué)是近年來迅速發(fā)展起來的研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)較為科學(xué)的一種方法[18]。2 血清藥理學(xué)研究

針對不同研究對象，首先要解決供體動物的選擇、給藥方案、采血時間等“含藥血清”的制備方法問題，因為不同種屬、年齡的動物對藥物吸收的差異，不同給藥劑量、采血時間造成的血藥成分、濃度的差異，加上血清內(nèi)源性成分的干擾，給血清有效成分的分離、鑒定造成了較大的困難[1]，如若忽視這些問題或處理不當，都會影響研究的真實性和可信性，從而使研究的重復(fù)性降低[19]。2.1 含藥血清供體動物的選擇

為了提高實驗結(jié)果的可靠性，縮小或避免動物血清以及動物血清和人類血清之間的理化、生物等特性上的差異，應(yīng)選用與人類生物學(xué)特性近似的動物制備含藥血清，最大限度的模擬體內(nèi)環(huán)境[20-21]。目前多選用大鼠和家兔。謝長等[22]在研究菝葜抗炎活性部位時，發(fā)現(xiàn)健康動物無法闡釋病理狀態(tài)下藥物入血的活性成分以及活性成分代謝過程。選擇健康動物還是模型動物要依據(jù)藥效實驗的結(jié)果確定。2.2 給藥方案的設(shè)計

現(xiàn)代方式是提高給藥劑量為原方藥劑量的3～20倍，針對目標成分連續(xù)給藥5～7個半衰期，或以主要成分的“平均穩(wěn)態(tài)濃度”為指導(dǎo)，確定給藥時間。也可以依據(jù)“給藥劑量＝臨床常用量×動物等效劑量系數(shù)×培養(yǎng)基內(nèi)的稀釋度”的方法計算，或臨床日用量的5、10、30倍等[23]，但是此法對藥味多、劑量大的復(fù)方不適用。按照新藥藥理研究的技

作者簡介：安莉萍，女，在讀碩士研究生，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，Tel：（0513）85116027，E-mail：anlipinggirl1987@126.com *通訊作者： 竇志華，男，博士，主任中藥師，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、臨床藥學(xué)與藥事管理工作，E-mail：zhihuadou@163.com

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術(shù)要求設(shè)計劑量給藥，將含藥血清制成凍干粉給實驗動物灌服，不僅提高實驗動物血中的含藥濃度，且有利于血清的儲藏保存，使能夠在動物血清中達到需要的濃度[24]。

目前文獻中有多種給藥方案[25]，如2次給藥法（間隔 2 h或4 h，末次給藥后1 h采血）、3次給藥法（連續(xù)灌胃3次，第1、2次間隔2 h，第2、3次間隔4 h，末次給藥后2 h采血）、7～10 d給藥法（每日灌胃1次，連續(xù)灌胃7～10 d）。由于中藥及其復(fù)方成分復(fù)雜，不同成分給藥后半衰期很難測定，盡管不同的文獻有不同的報道，但最終目的是盡量使取血時間落在血藥濃度最高峰期間。2.3 血液的采集

由于中藥成分復(fù)雜，不同藥物成分達峰時間不同，故對于采血時間很難有一個統(tǒng)一標準。理想的采血時間應(yīng)落在血藥濃度的高峰期，這樣能夠避免由于有效物質(zhì)尚未吸收或代謝殆盡而造成的假陰性結(jié)果[26]。李儀奎等[27]對大量的中藥藥物動力學(xué)參數(shù)進行分析后，提出的一種通行的給藥方案：2次?d－1，連續(xù)給藥3 d，末次給藥后1 h采血。一般來說，采血時間多集中在末次給藥后0.5～3 h，但中藥成分復(fù)雜，含藥血清有可能隨著時間的延續(xù)而轉(zhuǎn)化為藥物代謝血清，同時也可能會有相當一部分藥物成分血藥峰濃度已過或是尚未達到。總的來說要依據(jù)實驗動物消化生理特點和中藥吸收轉(zhuǎn)化特點確定取血時間范圍。

有學(xué)者查閱大量我國發(fā)表的有關(guān)“血清藥理學(xué)”的論著，發(fā)現(xiàn)絕大部分其實是“血漿藥理學(xué)”[28]；也有學(xué)者提出“血漿藥理學(xué)”優(yōu)于“血清藥理學(xué)”[29]。羅琳等[30]采用高效液相方法測定大鼠灌胃復(fù)方五仁醇膠囊后含藥血清和血漿中的五味子醇甲和五味子乙素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿中的成分含量明顯高于血清。但也不全盤否定血清藥理學(xué)方法，因為中藥成分十分復(fù)雜，有些用血清與血漿可能無多大差別[29]，因此，取血成分也成了中藥藥理學(xué)研究的重要目標。2.4 血液樣品的處理

由于血清樣品中內(nèi)源性雜質(zhì)多，樣品濃度低，樣品量受限，所以一般須經(jīng)過分離、純化和富集后再測定。目前，常用的處理方法[27]包括有機溶劑萃取法，沉淀蛋白法（有機溶劑、重金屬鹽、有機酸等沉淀蛋白法），熱水浴法，固相萃取法及超濾法等方法，這些方法的目的都是使血中移行成分被高度富集，干擾成分被盡量去除。通過比較不同的處理方法，最終選擇最佳的血清處理方法。2.5 正交試驗在含藥血清制備中的應(yīng)用

王宏軍等[31]利用響應(yīng)面法考察了采血時間、給藥濃度、給藥次數(shù)對銀翹天甘含藥血清中綠原酸、連翹苷含量的影響，優(yōu)化了銀翹天甘含藥血清的制備工藝。但目前含藥血清的制備研究多數(shù)采用藥效指標考察，已較少考慮化學(xué)指標，且忽視各影響因素的交互作用。竇志華[32]所在的課題組以動物是否造模、給藥間隔時間、取血時間、取血成分為考察因素，以含藥血清對損傷肝細胞增值及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶泄漏的影響及含藥血清中五味子乙素的含量為考察指標，采用藥理和化學(xué)指標相結(jié)合加權(quán)評分的正交試驗，考察了茵陳蒿湯含藥血清的制備方法。3 血清藥物化學(xué)研究

血清樣品分析常用的方法有氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用法、毛細管電色譜法、薄層掃描法、分光光度法、原子吸收光譜法等現(xiàn)代分析方法。通常采用建立中藥及其復(fù)方的提取物指標性成分的HPLC測定方法，然后在相同條件下，測定對照品、含藥血清、空白血清的指紋圖譜，分析比較中藥、空白血清、含藥血清3組的指紋圖譜，運用HPLC-DAD、HPLC-DAD-MS/MS等多種成熟的分析技術(shù)，對含藥血清中出現(xiàn)的移行成分進行歸屬和結(jié)構(gòu)解析等研究，對部分成分進行鑒定。但由于中藥進入體內(nèi)的化學(xué)成分的理化性質(zhì)各異、吸收部位或吸收速率不同、進入體內(nèi)的方式也不一致，因而給藥后血清藥物成分并非固定不變，且隨著時間變化可能發(fā)生組分變化。因此，對不同時間采血點的血清指紋圖譜進行分析，找出整個入血成分譜在體內(nèi)的經(jīng)時變化過程，建立血清藥物化學(xué)動態(tài)圖譜來反映中藥化學(xué)成分群在體內(nèi)的動態(tài)變化規(guī)律及其與藥物原型成分之間的相關(guān)性很有必要[33]。且隨著分析技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用，現(xiàn)可以實現(xiàn)生物體內(nèi)微量中藥成分的在線分離和鑒定[34-35]，在其基礎(chǔ)上，運用適當?shù)馁|(zhì)譜數(shù)據(jù)處理方法，進而快速、準確地研究確定血清中藥效成分[36]。

適合于從整體上分析復(fù)雜化學(xué)物質(zhì)組成穩(wěn)定性的中藥指紋圖譜已成為國內(nèi)外廣泛接受的質(zhì)量評價模式，同樣是中藥血清藥物化學(xué)研究的重要手段[37]。以往同類研究僅用1只動物的含藥血清來確認入血成分，指紋圖譜共有峰的確定可以排除動物個體差異引起的對藥物處置過程的差異[26]。竇志華[38]所在的課題組首次參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》，以復(fù)方五仁醇膠囊為研究對象建立了中藥復(fù)方含藥血清指紋圖譜，該研究比較了10批含藥血清與空白血清的色譜圖，，發(fā)現(xiàn)13個峰是各批含藥血清共有的，因此確定這13個峰為共有指紋峰，并將含藥血清色譜圖與體外制劑及對照品色譜圖比對，鑒定了其中3個成分。4 血清藥理學(xué)與血清藥物化學(xué)相結(jié)合的研究

含藥血清指紋圖譜能夠表征含藥血清中藥源性成分物質(zhì)數(shù)、物質(zhì)量和組成比例差異的整體情況，這些差異都會對效應(yīng)產(chǎn)生影響，運用數(shù)據(jù)處理技術(shù)將指紋圖譜數(shù)據(jù)和藥理學(xué)數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)，建立療效和化學(xué)成分的相關(guān)性，進而揭示產(chǎn)生效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

竇志華課題組[39]在國內(nèi)較早提出了“血清藥理學(xué)”與“血清藥物化學(xué)”研究相結(jié)合，通過含藥血清譜-效關(guān)系分析探討中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的新思路，并應(yīng)用該方法初步闡明了復(fù)方五仁醇膠囊保肝作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。顧英等[40]也通過研究芍藥甘草效應(yīng)組分血清指紋圖譜與藥效的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)芍藥苷、甘草黃酮效應(yīng)組分部分色譜峰峰面積與鎮(zhèn)痛作用的相關(guān)系數(shù)較大，血清中代謝產(chǎn)物的色譜峰峰面積與鎮(zhèn)痛作用的相關(guān)系數(shù)較大，提示以上成分與鎮(zhèn)痛作用有關(guān)。所以中藥入血成分研究中將血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)相結(jié)合，為藥物臨床前安全性和有效性評價提供重要的藥動學(xué)依據(jù)。

血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)相結(jié)合，有望將傳統(tǒng)中藥指紋圖譜的“色譜化學(xué)特征”推進到“色譜藥效特征”，有望從細胞分子水平揭示色譜中群體指紋峰與整體療效的作用機制，進而從根本上揭示中藥特定的藥理作用機制以及創(chuàng)新藥效研究體系[41]。5 展望

中藥血清藥物化學(xué)是以中藥化學(xué)、藥物分析、生物藥劑學(xué)、實驗動物學(xué)、中藥藥理學(xué)等學(xué)科為基礎(chǔ)的，在某種程度上科學(xué)、客觀地分析中藥及其復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)和中藥復(fù)方配

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伍的規(guī)律等，為中藥質(zhì)量標準制定、中藥新藥開發(fā)提供一條新的方法。應(yīng)用血清藥物化學(xué)方法研究的通塞脈微丸復(fù)方[42]、八珍湯[43]、地黃飲子[44]、驅(qū)蟲斑鳩菊[45]，應(yīng)用血清藥理學(xué)方法研究的痰瘀同治方[46]、牛黃參[47]、金欣口服液[48]以及2種方法相結(jié)合研究的虎杖[49]、板藍根[50]都是此種方法廣泛應(yīng)用、強大生命力的的體現(xiàn)。同時該方法也存在著一定的局限性：首先，藥物活性成分含量與儀器檢測精密度的矛盾。對于活性成分含量低的藥物，入血成分可能含量更低，若檢測儀器的靈敏度不高是無法檢測出此活性成分的存在，進而影響對藥物活性成分的推測及篩選。其次，人與動物的腸道菌群不同，所以血清提供者最好是人，但足夠血液的采集還會有些困難�？偟膩碚f，中藥血清藥理學(xué)與中藥血清藥物化學(xué)強大的生命力和應(yīng)用價值，隨著現(xiàn)代研究分析方法的不斷完善以及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，最終將為中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供強有力的工具，推動中藥現(xiàn)代化的發(fā)展。 參考文獻

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（收稿日期： 2013-02-03； 修回日期： 2013-02-26）

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥指紋圖譜中的應(yīng)用

聶平1，2，肖炳燚2，羅暉明2，李文莉2* （1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208；2.湖南省食品藥品檢驗研究院，

長沙 410001）

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；指紋圖譜；中藥質(zhì)量控制

中圖分類號：O657.63　　　　文獻標識碼：A　　　　文章編號：1672-2981(2013)07-0525-04doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2013.07.013

作為一種新的現(xiàn)代技術(shù)分析手段，超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-mass spectrome-try，UPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)在分離效能、靈敏度和專屬性等方面都有著巨大的優(yōu)勢，展現(xiàn)出強大的定性、定量分析能力，從而在藥物分析特別是中藥分析得到廣泛的運用。中藥是世界醫(yī)藥寶庫中的瑰寶之一，盡管中藥的現(xiàn)代化取得了一定的進展，但與中藥走出國門的迫切要求尚有差距。中藥指紋圖譜技術(shù)是目前公認的中藥質(zhì)量控制的有效方式之一，而中藥質(zhì)量控制現(xiàn)代化又是中藥現(xiàn)代化、邁出國門的關(guān)鍵之一[1]。本文綜述了近幾年使用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥指紋圖譜領(lǐng)域所取得的進展，以期為中藥指紋圖譜的深入研究提供線索和參考。1 超高效液相色譜-質(zhì)譜

超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）是一種結(jié)合了超高效液相色譜的高性能物理分離能力和質(zhì)譜特有的質(zhì)量分析能力，同時具有很高的靈敏度和選擇性的一種聯(lián)用分析技術(shù)[2]。超高效液相色譜（UPLC）采用小顆粒填料色譜柱（粒徑＜2 μm）和超高壓系統(tǒng)（壓力＞105 kPa），可以顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，又可以顯著地縮短了分析周期[3]。同時，UPLC也是質(zhì)譜檢測器的最佳液相色譜入口，一方面，UPLC系統(tǒng)達到最佳線速度時，其流動相流速一般在0.25～0.50 mL?min－1，這與質(zhì)譜能承受的流速更加匹配（API接口一般能承受0.20 mL?min－1），使離子化效率增加；另一方面，UPLC的分離度比HPLC有很大提高，其色譜峰擴展很小，峰濃度很高，這不僅有利于化合物的離子化，也有助于與基質(zhì)雜質(zhì)分離，在一定程度上能降低基質(zhì)效應(yīng)，從而使靈敏度和重現(xiàn)性得到提高[4-7]。此外，與傳統(tǒng)的高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）相比，UPLC-MS系統(tǒng)顯著提高了定量分析的重復(fù)性、可靠性以及定性分析的準確性。UPLC與MS聯(lián)用可使待分析組分基于物質(zhì)在流動相中分配差異和帶電粒子質(zhì)荷比的兩相之間差異而達到二維分離，可以最大限度的充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢，具有了卓越的分離性能和高通量的檢測水平，已成為復(fù)雜體系分離分析以及化合物結(jié)構(gòu)鑒定的良好平臺。該技術(shù)現(xiàn)已運用于藥物分析領(lǐng)域，在中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域的中藥指紋圖譜研究也漸漸興起[8 -10]。2 中藥指紋圖譜

鑒于中藥成分的復(fù)雜性，多數(shù)中成藥及中藥材的質(zhì)量控制尚未得到國際認可，從而阻礙了中藥的現(xiàn)代化和國際化。近年來，中藥指紋圖譜正逐步成為控制中成藥和中藥材質(zhì)量的有效手段[11]。美國食品及藥品管理局（FDA）于2000年在關(guān)于植物藥和其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制部分鑒別項下就在指導(dǎo)草案中就包含了指紋圖譜這一概念[12]。其后，歐盟草藥藥品注冊指南、衛(wèi)生組織（WHO）在其植物藥評價技術(shù)指南中也提出了運用指紋圖譜來檢測中藥和相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量[13-14]。

中藥指紋圖譜（? ngerprints of traditional Chinese medi-

基金項目：湖南省食品藥品檢驗研究院科技孵化基金（No.2012F008）；湖南省中醫(yī)藥管理局科研基金資助項目（No.201263）。

作者簡介：聶平，女，碩士，主要從事藥物分析研究，E-mail：nieping101@qq.com *通訊作者：李文莉，女，碩士，主任藥師，主要從事藥物分析研究，Tel：13973139612，E-mail：1838675867@qq.com

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  本文關(guān)鍵詞：中藥血清藥理學(xué)、血清藥物化學(xué)研究進展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：128867