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中藥有效成分分析的新方法新技術(shù)研究

發(fā)布時(shí)間:2016-09-30 11:22

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《復(fù)旦大學(xué)》 2012年

中藥有效成分分析的新方法新技術(shù)研究

劉揚(yáng)  

【摘要】:本論文以尋找中藥有效成分為出發(fā)點(diǎn),以色譜、質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ),嘗試探索中藥研究的新方法和新技術(shù)。建立了以提取手段、色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、基于細(xì)胞模型的活性成分篩選技術(shù)互相搭配的分離分析手段用于中藥有效成分的提取、分離、篩選和鑒定;同時(shí),針對(duì)中藥復(fù)方方劑的配伍比例進(jìn)行了優(yōu)化探索,并采取先分解再組合的實(shí)驗(yàn)思路建立基于中藥復(fù)方疊加效應(yīng)的有效成分篩選方法,并搭建了兩維色譜體系用于分離復(fù)方中藥中的復(fù)雜成分,從而實(shí)現(xiàn)了在綜合考量中藥多組分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)特點(diǎn)上的較為全面的活性物質(zhì)分離鑒定;此外,以基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)為出發(fā)點(diǎn),通過(guò)采用新基質(zhì)成功實(shí)現(xiàn)了高通量的中藥化合物篩選及長(zhǎng)鏈脂肪酸富集;在此基礎(chǔ)上,將MALDI-TOF-MS篩查擴(kuò)展到了固定酶抑制劑的高通量篩查,從而擴(kuò)寬了高通量MALDI-TOF-MS技術(shù)的篩查范圍。相關(guān)研究工作及成果的摘要如下: 第一章文獻(xiàn)綜述部分充分描述了中藥的豐富內(nèi)涵,突出了中藥有效成分在中藥質(zhì)量篩查中的重要性,以及探索中藥藥效機(jī)理對(duì)于藥物篩選與研發(fā)的必要性;介紹了色譜技術(shù)作為一種現(xiàn)代高效分離工具在中藥研究方面的發(fā)展與應(yīng)用;闡述了針對(duì)中藥有效成分研究的各種提取技術(shù),圍繞中藥多組分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)等特點(diǎn)展開(kāi)的數(shù)學(xué)實(shí)驗(yàn)思考,以及對(duì)于中藥有效成分篩查的體外生物模型研究方法;同時(shí),詳細(xì)描述了在化合物分離鑒定方面發(fā)揮重要作用的多維色譜、質(zhì)譜技術(shù),概述了當(dāng)前應(yīng)用于中藥分離的多維色譜模式以及在中藥研究中逐漸展露身手的質(zhì)譜鑒定技術(shù)。從中藥的提取預(yù)處理、到數(shù)學(xué)思維綜合考量、到多維色譜高效分離、到生物模型科學(xué)篩分、到質(zhì)譜技術(shù)高通量鑒定等多種化學(xué)生物技術(shù)相互結(jié)合的方式,對(duì)于中藥有效成分的分析具有十分重要的意義。通過(guò)描述該研究的基本思路和進(jìn)展?fàn)顩r,闡明了本課題選題及研究的學(xué)術(shù)意義和技術(shù)背景。 第二章將提取、分離、篩選、鑒定技術(shù)互相搭配,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥有效成分的分離分析。以中藥半枝蓮為分析樣本,探索不同提取方法對(duì)于其中有效成分-野黃芩苷的提取效率。通過(guò)納升級(jí)的色譜\質(zhì)譜聯(lián)用模式來(lái)定性鑒定和定量測(cè)量經(jīng)過(guò)紅外提取后的半枝蓮中的成分野黃芩苷。同時(shí),紅外提取的各個(gè)過(guò)程各個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)都進(jìn)行了優(yōu)化,從而驗(yàn)證了該提取方法的可靠性及高效性。同時(shí),通過(guò)與其他幾種提取方法,例如常規(guī)的加熱回流方法、超聲提取方法、微波提取方法等進(jìn)行比較可知,紅外提取能夠獲得更高的提取效率。同時(shí),中藥半枝蓮在納升級(jí)色譜質(zhì)譜聯(lián)用模式下得到了有效分離。通過(guò)參照野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜結(jié)構(gòu)信息,即可以快速準(zhǔn)確的確定半枝蓮中野黃芩苷的相關(guān)信息,從而實(shí)現(xiàn)高效定性鑒定。此外,通過(guò)建立野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)從而獲得相應(yīng)的定量信息,進(jìn)而得到較為滿(mǎn)意的方法有效性、線(xiàn)性以及檢測(cè)限。結(jié)果顯示,該方法在0.6至20ng mL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性良好,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9973,檢測(cè)限(LOD)為0.5ng mL-1(S/N=3)。 第三章將中藥復(fù)方作為分析對(duì)象,以探索復(fù)方配伍合理性,考量復(fù)方藥效疊加作用以及分析復(fù)方中藥復(fù)雜組分為出發(fā)點(diǎn),通過(guò)提取優(yōu)化、生物檢測(cè)細(xì)胞模型、兩維色譜分離及高效準(zhǔn)確質(zhì)譜鑒定等技術(shù),嘗試從更為全面的角度來(lái)分析紛繁復(fù)雜的中藥有效成分。首先,從探究復(fù)方方劑的配伍比例合理性出發(fā),針對(duì)特定的中藥復(fù)方方劑(該方劑由三種單味藥),在結(jié)合細(xì)胞生物篩查效果的基礎(chǔ)上,進(jìn)行方劑配伍比例值的優(yōu)化探索;其次,鑒于中藥各個(gè)組分之間的藥效疊加效應(yīng),從整體著眼,根據(jù)先分解再組合的思想重新進(jìn)行細(xì)胞增殖生物篩查,進(jìn)而從更為全面的角度對(duì)有效成分進(jìn)行篩查;然后,以紫杉提取液為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,繼續(xù)按照先分解再整合的實(shí)驗(yàn)思路對(duì)其中的有效成分進(jìn)行篩查,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,紫杉醇被確定為其中的有效成分,從而驗(yàn)證了這一篩選方法的有效性;最后,將親水色譜柱和反相色譜柱相結(jié)合,搭建兩維色譜分離系統(tǒng),經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,該系統(tǒng)具有更好的正交性和更高的峰容量,繼而將此兩維色譜分離體系與細(xì)胞模型、質(zhì)譜鑒定相結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)高通量的藥物篩選,對(duì)于藥物研發(fā)及藥物篩查具有重要意義。 第四章以基質(zhì)輔助激光解吸飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)為出發(fā)點(diǎn),將石墨烯和氧化石墨烯用作MALDI基質(zhì),來(lái)鑒定傳統(tǒng)中藥化合物。由于石墨烯和氧化石墨烯的表面積較大,從而避免了MALDI離子源與真空系統(tǒng)的污染。同時(shí),由于石墨烯優(yōu)異的電學(xué)、熱學(xué)以及機(jī)械性能使得MALDI-TOF-MS可以在濃度為100nM時(shí)達(dá)到穩(wěn)定的分析,且免除背景噪音干擾。實(shí)驗(yàn)采用當(dāng)歸和半枝蓮做為檢測(cè)樣本,將當(dāng)歸中的阿魏酸(m/z194)、半枝蓮中的野黃芩苷(m/z462)及漢黃芩素(m/z284)作為檢測(cè)的目標(biāo)化合物。實(shí)驗(yàn)表明,這兩種MALDI基質(zhì)對(duì)于中藥中組分的不同濃度不具有歧視效果。此外,石墨烯和氧化石墨烯還可以作為樣品的吸附劑展示其富集功效,從而使被測(cè)物的檢測(cè)限獲得較大幅度的降低。實(shí)驗(yàn)表明,這種MALDI-TOF-MS方法具有簡(jiǎn)單靈敏、快速經(jīng)濟(jì)、以及高通量等突出特點(diǎn),可以為中藥快速質(zhì)量篩查提供新的技術(shù)手段。 此外,還將石墨烯和氧化石墨烯用于富集長(zhǎng)鏈脂肪酸。將5種長(zhǎng)鏈脂肪酸,即十二烷酸(C12)、十四烷酸(C14),十六烷酸(C16),十八烷酸(C18)和二十烷酸(C20),用作為代表性樣本。由于石墨烯或氧化石墨烯較大的表面積和強(qiáng)烈相互作用,這5種長(zhǎng)鏈脂肪酸被石墨烯和氧化石墨烯有效富集,實(shí)現(xiàn)了高通量的檢測(cè)。同時(shí),本方法還可以成功用于低濃度下檢測(cè)實(shí)際生物樣品中的5種長(zhǎng)鏈脂肪酸樣本,從而證明了這種MALDI-TOF-MS方法可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單靈敏、快速經(jīng)濟(jì)并且高通量的檢測(cè)長(zhǎng)鏈脂肪酸。 第五章則在上述MALDI-TOF-MS檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上,將這種高通量篩查技術(shù)用于酶抑制劑的篩選中,該篩選由固定酶磁性碳球和以氧化石墨烯為基質(zhì)的MALDI-TOF-MS結(jié)合完成。首先,將乙酰膽堿酯酶(AChE)固定于3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GLYMO)修飾的磁性碳球上,該固定酶磁性碳球具有高效的酶活性和穩(wěn)定性,并可以將酶從底物和產(chǎn)物中有效分離出來(lái)。固定化乙酰膽堿酯酶AChE的效率則通過(guò)固定酶磁性碳球和樣品底物之間的反應(yīng)加以驗(yàn)證,而后續(xù)的定量分析底物乙酰膽堿和產(chǎn)物膽堿則通過(guò)基于氧化石墨烯為基質(zhì)的MALDI-TOF-MS方法完成,該MALDI-TOF-MS方法沒(méi)有背景干擾。乙酰膽堿的檢測(cè)限LOD是0.25fmol/μL,在0.5至250fmol/μL范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性值(R2=0.9998)。而膽堿則在0.05至15pmol/μL內(nèi)有很好的線(xiàn)性(R2=0.9994)和低檢測(cè)限LOD(0.15fmol/μL)。在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的濃度范圍內(nèi)有良好的準(zhǔn)確度和精確度。共有8種化合物(4種已知乙酰膽堿酯酶AChE抑制劑和4種沒(méi)有乙酰膽堿酯酶AChE抑制效果的對(duì)照化合物)用此方法進(jìn)行驗(yàn)證,所得結(jié)果證明該高通量篩分方法可以大大推動(dòng)日常酶抑制劑篩選的進(jìn)程。 總體而言,本論文圍繞中藥有效成分研究為核心,以色譜、質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ),著重發(fā)展新方法和新技術(shù)。首先,建立了包含提取、分離、篩選、鑒定的操作技術(shù)方法;其次,圍繞中藥復(fù)方這一復(fù)雜體系,著重優(yōu)化復(fù)方配伍比例值,探索基于復(fù)方藥效疊加作用基礎(chǔ)上的有效成分篩選方法,建立兩維色譜分離模式以實(shí)現(xiàn)更為全面的中藥復(fù)方分離分析;同時(shí),將MALDI質(zhì)譜技術(shù)成功用于中藥分子檢測(cè)及長(zhǎng)鏈脂肪酸富集,從而為高通量的中藥質(zhì)量篩查提供新的技術(shù)基礎(chǔ);最后,固定酶抑制劑的高通量MALDI檢測(cè)的實(shí)現(xiàn),大大拓寬了該MALDI質(zhì)譜檢測(cè)新技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域,具有極大潛力。本論文以色譜質(zhì)譜等現(xiàn)代儀器手段為基礎(chǔ),結(jié)合生物模型,著重發(fā)展中藥有效成分分離分析的新方法新技術(shù)。以高效靈敏、準(zhǔn)確可靠的分離、篩選、鑒定中藥中的有效成分為目標(biāo),發(fā)展了包含提取手段、分離鑒定、基于細(xì)胞模型的活性成分篩選、高通量中藥化合物鑒定等新技術(shù)和新方法,為中藥有效成分的分離分析提供了較為全面的研究方法。這些新方法和新技術(shù)的發(fā)展對(duì)于中藥有效成分的分離分析十分重要,有利于中藥的質(zhì)量篩查及物質(zhì)基礎(chǔ)探索。這些針對(duì)中藥有效成分分析的新方法和新技術(shù)的建立,有利于不斷的在中藥研究領(lǐng)域挖掘出更多的創(chuàng)新型解決方案。

【關(guān)鍵詞】:
【學(xué)位授予單位】:復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2012
【分類(lèi)號(hào)】:R284
【目錄】:

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【引證文獻(xiàn)】

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【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

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【相似文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞:中藥有效成分分析的新方法新技術(shù)研究,,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。



本文編號(hào):127072

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