本文關(guān)鍵詞：阿霉素和白藜蘆醇共遞送PLGA納米粒的制備及其抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

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【摘要】：目的:阿霉素(doxorubicin,DOX)對(duì)乳腺癌等腫瘤療效確切,價(jià)格低廉,但其毒副作用顯著,而且腫瘤細(xì)胞易對(duì)DOX產(chǎn)生耐藥,成為DOX臨床應(yīng)用最常見(jiàn)和難以克服的問(wèn)題。本研究以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)為內(nèi)核,采用茴香酰胺-聚乙二醇-膽固醇連接物(AA-PEG-hyd-CHOL)對(duì)PLGA納米粒進(jìn)行修飾,并將DOX和白藜蘆醇(resveratrol,RES)共同包封于PLGA納米粒中,得到阿霉素和白藜蘆醇共遞送PLGA納米粒(NPS),使DOX和RES在體內(nèi)具有腫瘤靶向性,延長(zhǎng)DOX和RES在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間,克服腫瘤細(xì)胞對(duì)DOX的耐藥,增強(qiáng)DOX的抗腫瘤作用,同時(shí)降低DOX對(duì)正常組織的毒性。方法:1.采用乳化溶劑揮發(fā)法制備表面修飾AA-PEG-hyd-CHOL的共同包封DOX和RES的PLGA納米粒(NPS),并用納米粒度及zeta電位分析儀和透射電鏡對(duì)納米粒進(jìn)行表征。2.采用熒光分光光度法研究NPS在不同pH(pH5.0,pH6.5和pH7.4)緩沖液中釋放DOX和RES的動(dòng)力學(xué)。3.采用MTT實(shí)驗(yàn)研究NPS、DOX、RES以及DOX和RES混合溶液(MIX)對(duì)mda-mb-231細(xì)胞、mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞的細(xì)胞毒性;通過(guò)試劑盒檢測(cè)nps、dox、res以及mix對(duì)mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞中caspase-3活性的影響。4.通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞對(duì)nps、dox、res以及mix的攝取,并觀察dox和res在mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞內(nèi)的分布。5.采用流式細(xì)胞術(shù)以及westernblot檢測(cè)nps、dox、res以及mix對(duì)mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞細(xì)胞周期以及周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。6.采用westernblot檢測(cè)nps、dox、res以及mix對(duì)mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白以及耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。7.采用mtt實(shí)驗(yàn)研究nps、dox、res以及mix對(duì)a549細(xì)胞的細(xì)胞毒性;采用westernblot檢測(cè)nps、dox、res以及mix對(duì)a549細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。8.復(fù)制裸鼠mda-mb-231/adr細(xì)胞移植瘤模型,以腫瘤體積為指標(biāo),觀察nps、dox、res的體內(nèi)抗腫瘤活性。采用活體成像儀觀察nps遞送dox和res在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布,采用熒光顯微鏡觀察nps遞送dox和res在正常器官組織和腫瘤組織切片中的分布。對(duì)組織切片進(jìn)行he染色,觀察nps、dox、res對(duì)正常器官組織以及腫瘤組織形態(tài)的影響。對(duì)腫瘤組織內(nèi)的蛋白進(jìn)行提取,觀察nps對(duì)腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白以及耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。9.復(fù)制裸鼠a549細(xì)胞移植瘤模型,以腫瘤體積為指標(biāo),觀察nps、dox、res的體內(nèi)抗腫瘤活性。采用活體成像儀觀察nps遞送dox和res在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布,采用熒光顯微鏡觀察nps遞送dox和res在正常器官組織和腫瘤組織切片中的分布。對(duì)組織切片進(jìn)行he染色,觀察nps、dox、res對(duì)正常器官組織以及腫瘤組織形態(tài)的影響。結(jié)果:1.nps的平均粒徑為(204±27)nm,zeta電位為(-15.8±0.8)mv,dox和res的載藥量分別為(4.6±1.4)%和(15.5±5.3)%。2.nps釋放dox和res呈ph依賴性,當(dāng)孵育時(shí)間為24h時(shí),nps在ph5.0的緩沖液中,dox和res的累積釋藥量分別達(dá)到了67.7%和81.4%;在ph7.4的緩沖液中,dox和res的累積釋藥量只有43.7%和43.6%。3.nps可劑量依賴性地抑制mda-mb-231細(xì)胞、mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞的生長(zhǎng);nps可濃度依賴性地增加mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞內(nèi)caspase-3的水平。4.nps可時(shí)間依賴性地增加dox和res在mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞核內(nèi)的蓄積。5.nps能夠顯著降低mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白cyclina、cyclind1、cdk2以及cdk4的表達(dá),誘導(dǎo)mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞發(fā)生g1期阻滯。6.nps可顯著降低mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞中耐藥相關(guān)蛋白p-gp、mrp-1和bcrp的表達(dá)。此外,nps還能夠顯著降低mda-mb-231/adr細(xì)胞和mcf-7/adr細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白nf-κb和bcl-2的表達(dá),并且上調(diào)bax的表達(dá)。7.nps可劑量依賴性地抑制a549細(xì)胞的生長(zhǎng),顯著降低a549細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白cyclina、cyclind1、cdk2以及cdk4的表達(dá),使細(xì)胞發(fā)生g1期阻滯。此外,nps能夠顯著降低a549細(xì)胞中nf-κb和bcl-2蛋白的表達(dá),并且上調(diào)bax蛋白的表達(dá)。8.nps可劑量依賴性地抑制裸鼠mda-mb-231/adr細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)。nps可有效遞送res和dox于mda-mb-231/adr細(xì)胞移植瘤組織中,并減少res和dox在其他正常器官組織中的蓄積,尤其是dox在心臟組織中的蓄積。he染色結(jié)果表明,nps可顯著降低dox的心臟毒性。westernblot結(jié)果表明,與空白對(duì)照組相比,nps可顯著降低腫瘤組織p-gp、bcrp、mrp-1、bcl-2以及nf-κb的表達(dá),同時(shí)上調(diào)bax和caspase-3的表達(dá)。9.nps可有效遞送res和dox于a549細(xì)胞移植瘤組織中,劑量依賴性地抑制裸鼠a549細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng),減少res和dox在正常器官組織中的蓄積,尤其是dox在心臟組織中的蓄積。he染色結(jié)果表明,nps可顯著降低dox的心臟毒性。結(jié)論NPS可有效遞送DOX和RES至腫瘤組織,減少了DOX在正常組織中的蓄積,降低了對(duì)正常組織的毒性,可劑量依賴性地抑制裸鼠MDA-MB-231/ADR細(xì)胞移植瘤以及A549細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)。NPS克服腫瘤細(xì)胞對(duì)DOX的耐藥、增強(qiáng)DOX的抗腫瘤活性與其下調(diào)耐藥相關(guān)蛋白(P-gp,MRP-1和BCRP)、NF-κB蛋白和BCL-2蛋白表達(dá),同時(shí)上調(diào)Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943;R96

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本文編號(hào)：1241484