本文關(guān)鍵詞：基于發(fā)形霞水母觸手轉(zhuǎn)錄組分析的抗菌活性蛋白的篩選、克隆表達(dá)與活性研究

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【摘要】：海洋微生物種類(lèi)豐富,不僅有陸地常見(jiàn)的病原微生物,也有海洋特有的致病微生物。長(zhǎng)時(shí)間與海水接觸的皮膚和軟組織創(chuàng)面極易出現(xiàn)弧菌感染,可在較短時(shí)間內(nèi)引發(fā)嚴(yán)重的損傷,甚至危及生命。此外,隨著濱海旅游業(yè)和海洋漁業(yè)的迅猛發(fā)展,海洋微生物引起感染的病例也越來(lái)越多見(jiàn)。常用抗生素對(duì)海洋致病微生物的感染治療效果欠佳,亟需開(kāi)發(fā)新型特異性抗海洋致病微生物的活性物質(zhì)。水母是一種常見(jiàn)的海洋浮游動(dòng)物,體腔開(kāi)放浸泡于海水中,其口腕及傘部外沿生有細(xì)長(zhǎng)的觸手,與海水接觸面積大,體表及機(jī)體組織長(zhǎng)期接觸多種致病性細(xì)菌和真菌。由于水母缺乏獲得性免疫系統(tǒng),因此其先天免疫防御系統(tǒng)功能強(qiáng)大,這對(duì)于生存在復(fù)雜海水表層環(huán)境中的水母抵御外界細(xì)菌、病毒入侵具有重要意義。盡管如此,目前對(duì)水母體內(nèi)先天免疫防御系統(tǒng)的組成、重要抗菌蛋白的序列信息、表達(dá)情況、活性水平等尚不清楚。第一部分:基于Illumina Hi Seq?2000平臺(tái)成功構(gòu)建了發(fā)形霞水母(Cyanea capillata)觸手組織轉(zhuǎn)錄組,共獲得了50,536條有效Unigenes序列。其中21,357條Unigenes在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中得到同源注釋。通過(guò)對(duì)其進(jìn)行分析篩選和功能分類(lèi),我們發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄組中存在大量免疫防御功能相關(guān)的編碼序列,如蛋白酶抑制劑、殺菌/通透性增加蛋白(BPI)、凝集素和熱休克蛋白等。此外,還篩選出多種毒性作用相關(guān)分子、疾病相關(guān)分子、抗氧化活性因子和膠原蛋白等具有重要功能的編碼序列。為今后深入研究水母免疫防御的物質(zhì)基礎(chǔ)和其他重要活性分子奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。第二部分:結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,從C.capillata轉(zhuǎn)錄組中篩選出兩個(gè)重要抗菌活性蛋白編碼序列,分別命名為CcKPI1(Cyanea capillata Kazal-type proteinase inhibitor 1)和CcBPI1(Cyanea capillata bactericidal/permeability-increasing protein 1),利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)序列進(jìn)行深入分析,發(fā)現(xiàn)CcKPI 1含176個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為19.02kDa,為分泌蛋白。CcKPI1含有三個(gè)高度保守的Kazal結(jié)構(gòu)域。多重比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析顯示,CcKPI1和其他物種來(lái)源的Kazal型絲氨酸蛋白酶(KPI)相似度較高,表明該分子為水母來(lái)源的KPI家族新成員。CcBPI1含478個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)分子質(zhì)量53.66 kDa,為分泌蛋白。CcBPI1含有兩個(gè)典型的BPI結(jié)構(gòu)域。多重比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析顯示,CcBPI1和其他物種來(lái)源的BPI相似度較高,表明該分子為水母來(lái)源的BPI家族新成員。成功構(gòu)建了CcKPI1原核表達(dá)重組質(zhì)粒CcKPI1-p ET24a、CcKPI1-p ET28a、CcKPI1-pET32a和CcKPI1-pGEX-6P-1,對(duì)比分析后確定最適合表達(dá)的重組質(zhì)粒為CcKPI1-pGEX-6P-1,其可在E.coli Rosetta(DE3)pLysS中高效、穩(wěn)定且以可溶性形式表達(dá),獲得與預(yù)期分子量一致的重組蛋白。通過(guò)?KTA蛋白分離純化系統(tǒng)得到高純度和高濃度的r CcKPI1融合蛋白,并經(jīng)SDS-PAGE電泳及GST抗體檢測(cè)鑒定為目的蛋白。同時(shí)成功構(gòu)建了CcBPI1原核表達(dá)重組質(zhì)粒CcBPI1-pET24a、CcBPI1-pET28a、CcBPI1-pET32a和CcBPI1-pGEX-6P-1,對(duì)比分析后確定可以正確表達(dá)的重組質(zhì)粒為Cc BPI1-pGEX-6P-1,其可在E.coli Rosetta(DE3)p LysS中少量表達(dá),獲得與預(yù)期分子量一致的重組蛋白。但由于rCcBPI1在原核系統(tǒng)中的表達(dá)量過(guò)低,不易純化,因此進(jìn)一步選擇畢赤酵母表達(dá)體系對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將重組表達(dá)質(zhì)粒CcBPI1-pPIC9成功轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中,但尚未獲得正確表達(dá)的重組融合蛋白,表達(dá)條件還需進(jìn)一步摸索和優(yōu)化。第三部分:實(shí)時(shí)定量PCR分析表明,CcKPI1與CcBPI1在檢測(cè)的所有組織中均有表達(dá)。CcKPI1在性腺中表達(dá)量最高,其他依次是觸手、傘蓋和口腕。CcBPI1在口腕中表達(dá)量最高,其他依次是傘蓋、性腺和觸手。rCcKPI1重組蛋白的活性檢測(cè):(1)通過(guò)比色法測(cè)定rCcKPI1蛋白抑制絲氨酸蛋白酶的能力和抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù),發(fā)現(xiàn)rCcKPI1蛋白能明顯抑制枯草桿菌蛋白酶A、蛋白酶K和彈性蛋白酶的活性,抑制常數(shù)分別為0.014、0.015和1.538μM,均為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。(2)通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫共聚焦實(shí)驗(yàn)檢測(cè)r CcKPI1蛋白和微生物結(jié)合的活性。結(jié)果表明,rCcKPI1蛋白能有效地結(jié)合多種微生物,包括金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、單胞霉菌和多種常見(jiàn)海洋致病性弧菌(創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、需鈉弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌),但未檢測(cè)到其與鰻弧菌和霍利斯弧菌的結(jié)合活性。(3)通過(guò)微量液體稀釋法檢測(cè)rCcKPI1蛋白抑制微生物生長(zhǎng)的能力,發(fā)現(xiàn)rCcKPI1蛋白可以顯著抑制大部分與其有結(jié)合活性的微生物(細(xì)菌、真菌、常見(jiàn)的海洋致病弧菌等)的生長(zhǎng)。結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了發(fā)形霞水母觸手組織轉(zhuǎn)錄組,首次獲取了發(fā)形霞水母的觸手轉(zhuǎn)錄譜。通過(guò)對(duì)其進(jìn)行分析篩選和功能分類(lèi),發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄組中存在大量重要生物學(xué)活性相關(guān)的編碼序列,包括免疫防御相關(guān)因子、毒性效應(yīng)分子、與疾病相關(guān)的分子、抗氧化相關(guān)蛋白和膠原蛋白等,為深入研究水母免疫防御的物質(zhì)基礎(chǔ)和其他重要活性分子奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。對(duì)篩選出的重要抗菌活性蛋白編碼序列(CcKPI1和CcBPI1)進(jìn)行了完整的生物信息學(xué)分析,通過(guò)重組克隆和誘導(dǎo)表達(dá),純化得到了兩個(gè)序列明確、功能單一的重要抗菌功能蛋白�；钚怨δ軝z測(cè)發(fā)現(xiàn),CcKPI1具有明顯的抑制絲氨酸蛋白酶的活性,抗菌功能研究發(fā)現(xiàn),該分子能結(jié)合多種致病微生物并顯著抑制微生物的生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明,CcKPI1具有明顯的抗菌活性,能有效對(duì)抗常見(jiàn)致病細(xì)菌、真菌和常見(jiàn)海洋致病弧菌,推測(cè)CcKPI1可能在C.capillata免疫防御中發(fā)揮重要作用。本研究也為開(kāi)發(fā)具有抗菌功能的新型海洋藥物提供了科學(xué)依據(jù)和新的資源途徑。
【關(guān)鍵詞】：水母 抗菌蛋白 Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑 殺菌/通透性增加蛋白 克隆表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R915
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 縮略詞表12-15
• 前言15-18
• 第一部分：發(fā)形霞水母觸手轉(zhuǎn)錄組的構(gòu)建與分析18-37
• 一、材料與方法18-21
• 二、結(jié)果21-35
• 三、討論35-36
• 四、小結(jié)36-37
• 第二部分：發(fā)形霞水母重要抗菌活性蛋白的分析篩選、克隆表達(dá)與純化37-70
• 一、材料與方法38-49
• 二、結(jié)果49-66
• 三、討論66-68
• 四、小結(jié)68-70
• 第三部分：發(fā)形霞水母重要抗菌活性蛋白的組織分布及其活性研究70-88
• 一、材料與方法70-76
• 二、結(jié)果76-85
• 三、討論85-87
• 四、小結(jié)87-88
• 全文總結(jié)88-90
• 參考文獻(xiàn)90-98
• 文獻(xiàn)綜述（已發(fā)表）98-108
• 參考文獻(xiàn)103-108
• 在讀期間參加科研工作情況108-110
• 致謝110

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1 肖良;郭玉峰;張靜;賀茜;聶菲;李s，

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