本文關鍵詞：基于發(fā)形霞水母觸手轉錄組分析的抗菌活性蛋白的篩選、克隆表達與活性研究

  更多相關文章： 水母 抗菌蛋白 Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑 殺菌/通透性增加蛋白 克隆表達

【摘要】：海洋微生物種類豐富,不僅有陸地常見的病原微生物,也有海洋特有的致病微生物。長時間與海水接觸的皮膚和軟組織創(chuàng)面極易出現(xiàn)弧菌感染,可在較短時間內(nèi)引發(fā)嚴重的損傷,甚至危及生命。此外,隨著濱海旅游業(yè)和海洋漁業(yè)的迅猛發(fā)展,海洋微生物引起感染的病例也越來越多見。常用抗生素對海洋致病微生物的感染治療效果欠佳,亟需開發(fā)新型特異性抗海洋致病微生物的活性物質(zhì)。水母是一種常見的海洋浮游動物,體腔開放浸泡于海水中,其口腕及傘部外沿生有細長的觸手,與海水接觸面積大,體表及機體組織長期接觸多種致病性細菌和真菌。由于水母缺乏獲得性免疫系統(tǒng),因此其先天免疫防御系統(tǒng)功能強大,這對于生存在復雜海水表層環(huán)境中的水母抵御外界細菌、病毒入侵具有重要意義。盡管如此,目前對水母體內(nèi)先天免疫防御系統(tǒng)的組成、重要抗菌蛋白的序列信息、表達情況、活性水平等尚不清楚。第一部分:基于Illumina Hi Seq?2000平臺成功構建了發(fā)形霞水母(Cyanea capillata)觸手組織轉錄組,共獲得了50,536條有效Unigenes序列。其中21,357條Unigenes在公共數(shù)據(jù)庫中得到同源注釋。通過對其進行分析篩選和功能分類,我們發(fā)現(xiàn)該轉錄組中存在大量免疫防御功能相關的編碼序列,如蛋白酶抑制劑、殺菌/通透性增加蛋白(BPI)、凝集素和熱休克蛋白等。此外,還篩選出多種毒性作用相關分子、疾病相關分子、抗氧化活性因子和膠原蛋白等具有重要功能的編碼序列。為今后深入研究水母免疫防御的物質(zhì)基礎和其他重要活性分子奠定了堅實的基礎。第二部分:結合文獻報道,從C.capillata轉錄組中篩選出兩個重要抗菌活性蛋白編碼序列,分別命名為CcKPI1(Cyanea capillata Kazal-type proteinase inhibitor 1)和CcBPI1(Cyanea capillata bactericidal/permeability-increasing protein 1),利用生物信息學分析軟件對序列進行深入分析,發(fā)現(xiàn)CcKPI 1含176個氨基酸殘基,預測分子質(zhì)量為19.02kDa,為分泌蛋白。CcKPI1含有三個高度保守的Kazal結構域。多重比對和進化樹分析顯示,CcKPI1和其他物種來源的Kazal型絲氨酸蛋白酶(KPI)相似度較高,表明該分子為水母來源的KPI家族新成員。CcBPI1含478個氨基酸殘基,預測分子質(zhì)量53.66 kDa,為分泌蛋白。CcBPI1含有兩個典型的BPI結構域。多重比對和進化樹分析顯示,CcBPI1和其他物種來源的BPI相似度較高,表明該分子為水母來源的BPI家族新成員。成功構建了CcKPI1原核表達重組質(zhì)粒CcKPI1-p ET24a、CcKPI1-p ET28a、CcKPI1-pET32a和CcKPI1-pGEX-6P-1,對比分析后確定最適合表達的重組質(zhì)粒為CcKPI1-pGEX-6P-1,其可在E.coli Rosetta(DE3)pLysS中高效、穩(wěn)定且以可溶性形式表達,獲得與預期分子量一致的重組蛋白。通過?KTA蛋白分離純化系統(tǒng)得到高純度和高濃度的r CcKPI1融合蛋白,并經(jīng)SDS-PAGE電泳及GST抗體檢測鑒定為目的蛋白。同時成功構建了CcBPI1原核表達重組質(zhì)粒CcBPI1-pET24a、CcBPI1-pET28a、CcBPI1-pET32a和CcBPI1-pGEX-6P-1,對比分析后確定可以正確表達的重組質(zhì)粒為Cc BPI1-pGEX-6P-1,其可在E.coli Rosetta(DE3)p LysS中少量表達,獲得與預期分子量一致的重組蛋白。但由于rCcBPI1在原核系統(tǒng)中的表達量過低,不易純化,因此進一步選擇畢赤酵母表達體系對其進行誘導表達。將重組表達質(zhì)粒CcBPI1-pPIC9成功轉入畢赤酵母GS115中,但尚未獲得正確表達的重組融合蛋白,表達條件還需進一步摸索和優(yōu)化。第三部分:實時定量PCR分析表明,CcKPI1與CcBPI1在檢測的所有組織中均有表達。CcKPI1在性腺中表達量最高,其他依次是觸手、傘蓋和口腕。CcBPI1在口腕中表達量最高,其他依次是傘蓋、性腺和觸手。rCcKPI1重組蛋白的活性檢測:(1)通過比色法測定rCcKPI1蛋白抑制絲氨酸蛋白酶的能力和抑制動力學參數(shù),發(fā)現(xiàn)rCcKPI1蛋白能明顯抑制枯草桿菌蛋白酶A、蛋白酶K和彈性蛋白酶的活性,抑制常數(shù)分別為0.014、0.015和1.538μM,均為競爭性抑制。(2)通過免疫印跡實驗和免疫共聚焦實驗檢測r CcKPI1蛋白和微生物結合的活性。結果表明,rCcKPI1蛋白能有效地結合多種微生物,包括金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、單胞霉菌和多種常見海洋致病性弧菌(創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、需鈉弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌),但未檢測到其與鰻弧菌和霍利斯弧菌的結合活性。(3)通過微量液體稀釋法檢測rCcKPI1蛋白抑制微生物生長的能力,發(fā)現(xiàn)rCcKPI1蛋白可以顯著抑制大部分與其有結合活性的微生物(細菌、真菌、常見的海洋致病弧菌等)的生長。結論:本研究成功構建了發(fā)形霞水母觸手組織轉錄組,首次獲取了發(fā)形霞水母的觸手轉錄譜。通過對其進行分析篩選和功能分類,發(fā)現(xiàn)該轉錄組中存在大量重要生物學活性相關的編碼序列,包括免疫防御相關因子、毒性效應分子、與疾病相關的分子、抗氧化相關蛋白和膠原蛋白等,為深入研究水母免疫防御的物質(zhì)基礎和其他重要活性分子奠定了堅實的基礎。對篩選出的重要抗菌活性蛋白編碼序列(CcKPI1和CcBPI1)進行了完整的生物信息學分析,通過重組克隆和誘導表達,純化得到了兩個序列明確、功能單一的重要抗菌功能蛋白�；钚怨δ軝z測發(fā)現(xiàn),CcKPI1具有明顯的抑制絲氨酸蛋白酶的活性,抗菌功能研究發(fā)現(xiàn),該分子能結合多種致病微生物并顯著抑制微生物的生長。以上結果表明,CcKPI1具有明顯的抗菌活性,能有效對抗常見致病細菌、真菌和常見海洋致病弧菌,推測CcKPI1可能在C.capillata免疫防御中發(fā)揮重要作用。本研究也為開發(fā)具有抗菌功能的新型海洋藥物提供了科學依據(jù)和新的資源途徑。
【關鍵詞】：水母 抗菌蛋白 Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑 殺菌/通透性增加蛋白 克隆表達
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R915
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 縮略詞表12-15
• 前言15-18
• 第一部分：發(fā)形霞水母觸手轉錄組的構建與分析18-37
• 一、材料與方法18-21
• 二、結果21-35
• 三、討論35-36
• 四、小結36-37
• 第二部分：發(fā)形霞水母重要抗菌活性蛋白的分析篩選、克隆表達與純化37-70
• 一、材料與方法38-49
• 二、結果49-66
• 三、討論66-68
• 四、小結68-70
• 第三部分：發(fā)形霞水母重要抗菌活性蛋白的組織分布及其活性研究70-88
• 一、材料與方法70-76
• 二、結果76-85
• 三、討論85-87
• 四、小結87-88
• 全文總結88-90
• 參考文獻90-98
• 文獻綜述（已發(fā)表）98-108
• 參考文獻103-108
• 在讀期間參加科研工作情況108-110
• 致謝110

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本文編號：1072916