本文關(guān)鍵詞：Arg9-EGFP綠色熒光蛋白的穿膜效果研究

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【摘要】：藥物分子進入細胞是藥物投遞系統(tǒng)中非常重要的一個環(huán)節(jié)。哺乳動物細胞有膜的存在,使蛋白質(zhì)、核酸類等許多具有生物活性的大分子藥物無法直接進入細胞,導(dǎo)致此類藥物在實際使用中出現(xiàn)許多局限,難以起到治療效果。細胞穿膜肽能攜帶多種活性目的分子高效進入細胞。近20年來,多種細胞穿膜肽被陸續(xù)證實并報道。對細胞穿膜肽結(jié)構(gòu)及生物化學(xué)性質(zhì)的研究,發(fā)現(xiàn)細胞穿膜肽具有以下共同特性:(1)都包含一段長短不一的正電荷多肽,富含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸;(2)穿膜肽二級結(jié)構(gòu)中都存在α-螺旋空間結(jié)構(gòu)。其中,富含精氨酸的穿膜多肽被深入研究,發(fā)現(xiàn)一段單獨的多聚精氨酸就能夠順利實現(xiàn)跨膜,其穿膜效應(yīng)不具有細胞選擇性,使之成為目前應(yīng)用最廣泛的一類穿膜肽。為實現(xiàn)外源蛋白有效穿膜的過程,本文探討了細胞穿膜肽Arg9介導(dǎo)的綠色熒光蛋白蛋白的穿膜作用。通過構(gòu)建p ET-15b-Arg9-EGFP原核表達載體,利用適宜濃度的IPTG誘導(dǎo)DE3大腸桿菌原核表達體系以及His標(biāo)簽純化系統(tǒng),純化獲得Arg9-EGFP蛋白;運用乳腺癌MCF-7細胞模型,檢測Arg9穿膜肽的穿膜效果。實驗結(jié)果表明,我們成功制備了Arg9-EGFP融合蛋白。與不含Arg9穿膜肽的EGFP蛋白相比,Arg9-EGFP融合蛋白可有效穿膜進入細胞內(nèi)部,并顯示劑量依賴性。熒光檢測結(jié)果表明,進入細胞的Arg9-EGFP蛋白主要聚集在細胞漿內(nèi)。本研究表明Arg9細胞穿膜肽可以有效介導(dǎo)目標(biāo)蛋白進入細胞,并保持目標(biāo)蛋白的大分子活性,有望成為實現(xiàn)特定蛋白穿膜并發(fā)揮藥物作用的潛在工具,為蛋白類新型藥物的投遞方式帶來新思路。
【關(guān)鍵詞】：質(zhì)粒 穿膜肽 融合蛋白 蛋白純化
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R945
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-21
• 1.1 前言10-11
• 1.2 Arg9穿膜肽的簡介11-12
• 1.3 穿膜肽的穿膜機制12-15
• 1.3.1 穿膜肽胞吞作用機制13-14
• 1.3.2 富含精氨酸類細胞穿膜肽的直接穿膜機制研究14-15
• 1.4 細胞穿膜肽面臨的挑戰(zhàn)和問題15-17
• 1.5 穿膜肽的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景17-19
• 1.6 選題背景及內(nèi)容提要19-21
• 1.6.1 選題背景19-20
• 1.6.2 本文主要研究內(nèi)容20-21
• 第2章 Arg9-EGFP融合蛋白的原核表達體系的構(gòu)建21-28
• 2.1 前言21
• 2.2 實驗試劑21-22
• 2.3 實驗儀器22
• 2.4 pET-15b-EGFP、pET-15b-Arg9-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建22-23
• 2.5 pET-15b-EGFP、pET-15b-Arg9-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建23-25
• 2.6 實驗結(jié)果與分析25-26
• 2.6.1 EGFP和Arg9-EGFP目的片段的擴增25-26
• 2.6.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定瓊脂糖電泳結(jié)果26
• 2.7 本章小結(jié)26-28
• 第3章 EGFP、Arg9-EGFP融合蛋白的原核誘導(dǎo)表達28-34
• 3.1 前言28
• 3.2 實驗試劑28-29
• 3.3 實驗儀器29
• 3.4 實驗方法29-32
• 3.4.1 EGFP、Arg9-EGFP融合蛋白的原核誘導(dǎo)表達時間的摸索29-31
• 3.4.2 EGFP、Arg9-EGFP融合蛋白的誘導(dǎo)、表達、提取和純化;31-32
• 3.5 實驗結(jié)果與分析32-33
• 3.5.1 蛋白表達體系的誘導(dǎo)時間摸索32-33
• 3.5.2 純化蛋白以及其SDS-PAGE純度分析33
• 3.6 本章小結(jié)33-34
• 第4章 Arg9-EGFP綠色熒光蛋白的穿膜效果研究34-42
• 4.1 前言34
• 4.2 實驗儀器34
• 4.3 實驗材料34-35
• 4.4 實驗方法35-39
• 4.4.1 細胞復(fù)蘇35
• 4.4.2 細胞傳代35-36
• 4.4.3 細胞凍存36
• 4.4.4 細胞計數(shù)36
• 4.4.5 Arg9-EGFP綠色熒光蛋白處理細胞36-37
• 4.4.6 Hoechst染色37
• 4.4.7 Western Bloting（WB）37-39
• 4.5 實驗結(jié)果與分析39-40
• 4.5.1 熒光顯微鏡檢測穿膜肽穿膜效率39-40
• 4.5.2 免疫印跡檢測穿膜肽穿膜效率40
• 4.6 本章小結(jié)40-42
• 結(jié)論與展望42-44
• 參考文獻44-51
• 附錄A 英文縮寫51-52
• 附錄B 常用試劑與緩沖溶液配方52-53
• 附錄C 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文53-54
• 致謝54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Baculoviruses as Vectors in Mammalian Cells[J];Virologica Sinica;2007年02期

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本文編號：1018444