本文關鍵詞：基于HER2靶標的抗體偶聯(lián)藥物（ADCs）內(nèi)吞機制研究

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【摘要】：乳腺癌已成為威脅女性生命健康的重要疾病之一,且患乳腺癌的女性數(shù)量逐年增高,其中20-30%是HER2過表達型患者。HER2作為一種臨床驗證的癌癥靶標,治療HER2過量表達腫瘤的藥物是科學界研究的熱點。目前治療性單抗由于具有靶向性好、自身異源性低及毒副作用低等優(yōu)點,在乳腺癌的臨床治療中應用廣泛。但由于一部分HER2陽性的乳腺癌患者對單抗治療不敏感,同時伴隨著耐藥性的產(chǎn)生,從而為其臨床治療提供了挑戰(zhàn)。由此,治療HER2過表達的抗體偶聯(lián)藥物(Antibody-drugs conjugates,ADCs)應運而生。ADCs是一類新型、高效的治療腫瘤的藥物,并以其優(yōu)良的研究效果和低毒性成為乳腺癌治療的新星�？笻ER2的ADCs以抗體為載體,通過偶聯(lián)劑與細胞毒性藥物連接,利用抗體特異性識別靶細胞,細胞毒藥物靶向作用從而發(fā)揮強抗腫瘤作用。ADC藥物的作用機制是當抗體與腫瘤靶點結合后,ADCs進入腫瘤細胞,在細胞內(nèi)裂解釋放效應分子并引起細胞的凋亡。而ADCs高效殺傷腫瘤細胞的效應依賴于其是否能夠特異、有效地進入腫瘤細胞,及細胞毒藥物能否有效釋放,因此研究其內(nèi)吞,胞內(nèi)轉運,清除在藥物評價中十分重要。但目前,對HER2介導的內(nèi)吞和胞內(nèi)轉運的機制仍知甚少。本課題選用的治療HER2過表達型乳腺癌ADCs作為研究對象,即T-DM1(Trastuzumab與DM1通過硫醚鍵連接)、P-DM1(Pertuzuma與DM1通過硫醚鍵連接)、P-MMAE(Pertuzumab通過二肽鍵偶聯(lián)MMAE)、WBP265(曲妥珠單抗引入非天然氨基酸的265SD單抗與MMAF偶聯(lián))。其中T-DM1已于2013年上市,P-DM1、P-MMAE、WBP265均為正在研發(fā)的新藥。通過監(jiān)測單抗、細胞毒藥物、偶聯(lián)鍵等因素,對ADCS與受體相互作用以及它們在體外結合的影響,驗證上述因素是否對它們的內(nèi)吞速率和清除速率有影響,進一步闡述它們的作用機制。本文分為兩部分,第一部分研究抗體偶聯(lián)藥物與HER2受體間的相互作用,第二部分研究抗體偶聯(lián)藥物在體外的內(nèi)吞機制。第一部分研究不同ADCs與HER2受體間的相互作用。首先用SPR技術測定這些抗體與抗原相互作用。本文采用的是捕獲法,具體實驗方法:利用氨基氨基偶聯(lián)試劑盒將抗人Ig G(Fc)抗體偶聯(lián)到CM5傳感芯片葡聚糖基質表面,首先注射待測樣品于檢測通道,然后將HER2受體溶液(HBS-EP+緩沖液五個等梯度稀釋液)注射于檢測通道和參比通道,使得其與藥物相結合;最后注射3M Mg Cl2進行芯片再生以備下一循環(huán)使用。用檢測通道的響應值減去參比通道響應值,以扣除非特異性結合、補償折射率所帶來的誤差。設置單循環(huán)動力學分析方法并運行。所得的曲線采用1:1 Lamgmuir模型描述擬合動力學模型,Biaevaluation分析軟件進行數(shù)據(jù)處理,計算供試品的親和動力學。KD值越小,抗原抗體的親和力越大。用Biacore T200檢測ADCs及陽性對照物(單抗:Trastuzumab、Pertuzumab、265SD)與受體HER2的KD值在10-10左右,故均具有很高的親和力,活性高。根據(jù)Biacore判定標準一般認為KD值相差五倍以內(nèi),可以判定為親和能力沒有差別。T-DM1(KD值為133.9 p M)與HER2的親和力相當于Trastuzumab(KD值為94.2 p M);P-DM1、P-MMAE與HER2的親和力(P-DM1 KD值為722.1 p M,P-MMAE KD值為326.7 p M)大于Pertuzumab與HER2的親和力(KD值為1191 p M),其中P-MMAE又強于P-DM1;同時單抗265SD與配體的親和力與WBP265相當(265SD KD值為606.6 p M,WBP265KD值為577.3 p M)。與受體的親和力,T-DM1和WBP265SD等于其對應的單抗,說明單抗連接小分子藥物后對親和力影響不大;但是連接效應分子后,對帕妥珠單抗影響較大,親和力發(fā)生了較大影響。三種單抗與HER 2的親和力是Trastuzumab最強,265SD稍強,Pertuzumab最弱。同時T-DM1與HER 2的親和力大于P-DM1,因為T-DM1結合速率遠大于P-DM1。接著,采用免疫熒光的方法分別測定ADCs、單抗與HER2的體外結合性質。流式細胞儀結果可見抗體與受體結合存在量效關系,在濃度0.3125-20μg/ml范圍內(nèi),隨著供試品濃度的增加,平均熒光強度(MFI)逐漸增強,濃度到達20μg/ml后,供試品濃度增加,熒光強度不變,符合受體的結合特征,即配體與受體結合具有飽和性。通過ADCs、單抗分別與HER2的結合曲線可知:T-DM1與HER2結合能力稍弱于Trastuzumab;P-DM1、P-MMAE弱于Pertuzumab,但P-MMAE稍強于P-DM1;WBP265弱于265SD。比較不同單抗其他結構相同的T-DM1、P-DM1的結合曲線可知,P-DM1稍大于T-DM1。比較三種單抗的結合能力,265SD最強,Pertuzumab其次,Trastuzumab最弱。第二部分研究不同ADCS在體外的內(nèi)吞機制。研究發(fā)現(xiàn),ADCS內(nèi)吞進入胞內(nèi)后,在溶酶體中降解。首先采用激光掃描共聚焦顯微鏡實時檢測ADCs藥物在SKBR3細胞中的轉運和內(nèi)吞速率,陽性細胞經(jīng)T-DM1處理4小時后內(nèi)吞進入到溶酶體,而單抗曲妥珠處理2小時到達溶酶體,說明T-DM1的內(nèi)吞速率小于Tratuzumab;P-DM1與細胞共培養(yǎng)6小時后內(nèi)吞進入溶酶體,P-MMAE處理8小時內(nèi)吞到達溶酶體,而帕妥珠單抗4小時處理后,內(nèi)吞到達溶酶體,說明P-DM1、P-MMAE的內(nèi)吞速率小于Pertuzumab;而抗體偶聯(lián)物WBP265和265SD單抗與細胞共培養(yǎng)8小時后均到達溶酶體,說明兩者的內(nèi)吞速率相同。在陰性細胞MCF7中,未觀察到內(nèi)吞現(xiàn)象。綜合可知,抗HER2的抗體偶聯(lián)藥物的內(nèi)吞速率小于其單抗的內(nèi)吞速率。這一結果與體外結合性質研究的結果一致。接著應用免疫熒光的方法測定ADCs和單抗體外清除率。流式細胞儀結果顯示,四種不同ADCs在乳腺癌SKBR3細胞內(nèi),平均熒光強度隨著孵育時間延長而減弱,對比4℃處理條件下一直未變的平均熒光強度,表明ADCs內(nèi)吞進入細胞后被降解。同時從體外消除曲線,可得出T-DM1的清除率小于曲妥珠單抗的清除率;P-DM1、P-MMAE的清除率小于帕妥珠單抗的清除率;WBP265的清除率小于265SD單抗的清除率。即抗體偶聯(lián)藥物的清除率普遍小于單抗的清除率。這一研究結果與體外結合性質、內(nèi)吞速率實驗一致。綜上,本文應用SPR技術揭示ADCs及其相應地單抗與受體的相互作用的基本規(guī)律,觀察其親和動力學特征,進一步在體外應用免疫熒光的方法測定結合性質,為在分子、細胞水平上深刻理解乳腺癌導向治療的機制、合理制定導向治療方案及未來主攻方向等提供了重要理論依據(jù)。本研究中通過比較其清除率和內(nèi)吞速率,為內(nèi)化細胞生物學理論增添了新的內(nèi)容,對藥物機制研究、抗體偶聯(lián)藥物的最終優(yōu)化和臨床應用具有重要的指導意義。
【關鍵詞】：SPR技術 HER2受體 抗體偶聯(lián)藥物 內(nèi)吞
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-19
• 第一章 抗體偶聯(lián)藥物與HER2受體間的相互作用19-38
• 第一節(jié) 基于SPR法測定抗體偶聯(lián)物與HER2受體的親和力19-29
• 1.實驗試劑和儀器19-20
• 2 實驗方法20-21
• 3 實驗結果21-28
• 4 小結28-29
• 第二節(jié) 抗體偶聯(lián)藥物的熒光素標記及定量29-32
• 1 實驗試劑和儀器29
• 2 實驗方法29
• 3 實驗結果29-31
• 4 小結31-32
• 第三節(jié) 流式細胞儀測定抗體偶聯(lián)藥物與HER 2 受體的結合32-38
• 1 實驗試劑和儀器32
• 2 實驗方法32-33
• 3 實驗結果33-37
• 4 小結37-38
• 第二章 抗體偶聯(lián)藥物在體外的內(nèi)吞實驗38-51
• 第一節(jié) 抗體偶聯(lián)藥物在體外SKBR3細胞的的定位實驗38-46
• 1.實驗試劑和儀器38
• 2 試驗方法38
• 3 實驗結果38-45
• 4 小結45-46
• 第二節(jié) 抗體偶聯(lián)藥物在體外的清除率實驗46-51
• 1.實驗試劑和儀器46
• 2 試驗方法46
• 3 實驗結果46-50
• 4 小結50-51
• 討論51-54
• 結論54-55
• 參考文獻55-62
• 個人簡歷62-63
• 致謝63

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本文編號：1008518