本文關(guān)鍵詞：NGR修飾的多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體的研究

  更多相關(guān)文章： 多西他賽 腫瘤靶向 pH敏感 長循環(huán)脂質(zhì)體 NGR

【摘要】：多西他賽自臨床應(yīng)用以來,治療腫瘤的效果顯著,上市制劑的臨床應(yīng)用越來越廣泛,但其胃腸道和血液系統(tǒng)毒性、過敏反應(yīng)等毒副作用,影響臨床治療,給患者帶來痛苦。因此通過新型的藥物遞送系統(tǒng)的研究,進一步提高藥物的治療指數(shù),降低毒副作用,是目前相關(guān)研究的熱點之一。在藥物遞送系統(tǒng)的研究中,通過納米材料、生物技術(shù)和物理化學等理論設(shè)計腫瘤靶向脂質(zhì)體,從而進一步提高藥物療效,降低毒副作用,是研究的重要方向。普通脂質(zhì)體由于易被網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞吞噬并清除而難以進入腫瘤組織,聚乙二醇修飾的脂質(zhì)體延長其在血液中的滯留時間,容易透過腫瘤組織的毛細血管,更有效地在腫瘤部位滲漏和聚集。利用靶向腫瘤本身及腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞上的某些受體的多肽對脂質(zhì)體表面進行修飾,能夠進一步增強制劑的靶向性,降低毒副作用。本課題在普通pH敏感脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上,制備被動和主動腫瘤靶向相結(jié)合的NGR修飾的多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體：通過聚乙二醇(PEG)修飾達到長循環(huán)功能,減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬和清除,提高制劑體內(nèi)穩(wěn)定性；采用腫瘤靶向多肽NGR進行修飾,使脂質(zhì)體能夠主動靶向至腫瘤部位,提高藥物在腫瘤組織的聚集量：利用琥珀酸膽固醇單酯(CHEMS)的pH敏感機制靶向釋放藥物,共同實現(xiàn)靶向遞送和控制釋放的功能。本文通過處方篩選制備了多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體(DTX/PLL)和NGR修飾的多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體(DTX/NGR-PLL),研究脂質(zhì)體的理化性質(zhì)和體外釋放特性,并考察了脂質(zhì)體的藥物動力學性質(zhì)和體內(nèi)外腫瘤靶向性。主要研究方法與結(jié)果如下：1. DTX/PLL的制備與評價采用HPLC測定多西他賽的含量,建立測定脂質(zhì)體包封率的方法。在多西他賽pH敏感脂質(zhì)體處方研究的基礎(chǔ)上,以脂質(zhì)體包封率為指標,通過單因素篩選確定脂質(zhì)體中長循環(huán)材料CHEMS-PEG2000的用量。結(jié)果表明長循環(huán)材料的用量為磷脂酰乙醇胺(PE)的5%時包封率最高,包封率為71.88+0.99%,為最優(yōu)處方。按照最優(yōu)處方制備脂質(zhì)體,并對其進行考察,結(jié)果表明所制脂質(zhì)體外觀形態(tài)良好,粒徑為192.54±7.73 μm,Zeta電勢為-27.9±0.9 mV。為研究脂質(zhì)體釋放的pH敏感特性,在不同pH釋放介質(zhì)中進行體外釋放實驗,測定不同制劑的體外釋藥特征。結(jié)果表明與多帕菲@相比DTX/PLL在pH7.4介質(zhì)中較穩(wěn)定,72 h時累計釋放率達到81.88%,證明其具有緩釋功能：而在pH5.0介質(zhì)中DTX/PLL釋放加快,48 h時累計釋放率為85.50%,證明了其pH敏感的體外釋放特性。2. DTX/NGR-PLL的制備與評價為進一步提高脂質(zhì)體的腫瘤靶向性,通過在脂質(zhì)體表面飾靶向多肽實現(xiàn)腫瘤的主動靶向。設(shè)計合成具有氨肽酶(CD13)受體靶向的多肽NGR的CHEMS-PEG2000-GNGRG聚合物,以脂質(zhì)體包封率、細胞熒光攝取強度為指標,在DTX/PLL的基礎(chǔ)上進行處方篩選,確定DTX/NGR-PLL的最優(yōu)處方中靶向材料用量為PE的0.8%；最優(yōu)處方所制脂質(zhì)體脂質(zhì)體外觀形態(tài)良好,粒徑為202.34±7.40 nm,Zeta電勢為-25.7±2.9 mV；體外釋放實驗表明,NGR修飾后的脂質(zhì)體DTX/NGR-PLL中藥物釋放行為與未修飾的脂質(zhì)體DTX/PLL相似,DTX/NGR-PLL在pH7.4介質(zhì)中72 h時累計釋放率為81.58%,而在pH5.0介質(zhì)中脂質(zhì)體48 h時累計釋放率為89.39%,證明其緩釋及pH敏感特性；初步穩(wěn)定性評價實驗中,室溫(25℃C)條件下保存3周、低溫4℃冰箱中6周,脂質(zhì)體溶液的外觀性狀、粒徑和EE的變化不大,穩(wěn)定性較好。3.藥物動力學研究為評價脂質(zhì)體的體內(nèi)長循環(huán)功能,本部分以多帕菲@和普通pH敏感脂質(zhì)體(DTX/PSL)作為對照制劑,考察DTX/PLL和DTX/NGR-PLL在大鼠體內(nèi)的藥代動力學特性。DTX/PLL和DTX/NGR-PLL在各個時間點的血藥濃度較多帕菲@和DTX/PSL溶液組明顯提高,AUC0-∞值都顯著增大,DTX/PLL和DTX/NGR-PLL(AUC0-∞=41.521和AUC0-∞=46.430),較Duopafei(?)(AUC0-∞=12.290)和DTX-PSL(AUC0-∞=28.749)組明顯提高,與普通脂質(zhì)體(DTX/PSL)相比,PEG修飾的兩種長循環(huán)脂質(zhì)體(DTX/NGR-PLLDTX/PLL)在大鼠體內(nèi)的滯留時間(MRT)更加延長,MRT0-∞:DTX/NGR-PLL DTX/PLLDTX/PSL,實驗結(jié)果表明DTX/PLL和DTX/NGR-PLL均可明顯延長藥物的MRT,具有顯著的體內(nèi)長循環(huán)的作用。4.體內(nèi)、外的靶向性研究通過MCF-7[CD13(-)]和HT-1080細胞[CD13(+)]考察脂質(zhì)體的體外腫瘤靶向性。MTT法測定的細胞毒性結(jié)果表明DTX/PLL和DTX/NGR-PLL的抗腫瘤活性較游離藥物明顯增強,IC50值均降低,且DTX/NGR-PLL對HT-1080的細胞毒性較DTX/PLL明顯增強；細胞攝取實驗中兩種細胞對脂質(zhì)體的攝取較游離溶液明顯增強,兩種細胞對兩種制劑攝取的不同,驗證了脂質(zhì)體中NGR多肽的靶向作用。熒光探針標記的脂質(zhì)體在荷瘤裸鼠腫瘤組織的熒光切片實驗表明,兩種脂質(zhì)體均能成功靶向至腫瘤組織,靶向肽修飾后的靶向效果更明顯,證明DTX/NGR-PLL在體內(nèi)具有較強的腫瘤靶向能力。給藥組小鼠組織、切片表明,DTX/NGR-PLL脂質(zhì)體具有良好的安全性,對主要器官無明顯毒性。本文合成了NGR修飾的靶向材料,通過篩選制備了DTX/PLL和DTX/NGR-PLL,所制脂質(zhì)體外觀良好,粒徑均勻,體外釋放實驗證明了脂質(zhì)體的pH敏感特性,大鼠體內(nèi)藥物動力學實驗驗證了體內(nèi)長循環(huán)作用,體內(nèi)外靶向性實驗證明了腫瘤的靶向性。
【關(guān)鍵詞】：多西他賽 腫瘤靶向 pH敏感 長循環(huán)脂質(zhì)體 NGR
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R943
【目錄】：

• 中文摘要10-13
• ABSTRACT13-16
• 符號說明16-18
• 前言18-24
• 第一章 多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體的研究24-44
• 一、儀器與試劑24
• 1. 儀器24
• 2. 試劑24
• 二、方法與結(jié)果24-42
• 1. 多西他賽測定方法的建立24-29
• 1.1 檢測波長的確定24-25
• 1.2 色譜條件25
• 1.3 專屬性實驗25-26
• 1.4 定量限及檢測限的考察26
• 1.5 標準曲線的繪制26-27
• 1.6 精密度實驗27-28
• 1.7 回收率實驗28-29
• 2. 包封率與載藥量測定方法的建立29-32
• 2.1 方法回收率30-31
• 2.2 加樣回收率31-32
• 3. 多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體中CHEMS-PEG_(2000)用量的篩選32
• 4. 多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體的制備與評價32-34
• 4.1 DTX/PLL的制備重現(xiàn)性考察32-33
• 4.2 DTX/PLL的外觀形態(tài)33
• 4.3 DTX/PLL的粒徑分布及Zeta電勢33-34
• 5. 多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體的體外釋放實驗34-42
• 5.1 多西他賽體外釋放實驗高效液相色譜分析方法的建立34-39
• 5.2 藥物和DTX/PLL的體外釋放曲線39-42
• 三、討論42-44
• 第二章 NGR修飾的多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體的研究44-55
• 一、儀器與試劑44
• 1. 儀器44
• 2. 試劑44
• 二、方法與結(jié)果44-53
• 1. CHEMS-PEG_(2000)-GNGRG的合成與表征44-47
• 1.1 CHEMS-PEG_(2000)-GNGRG的合成44-45
• 1.2 CHEMS-PEG_(2000)-GNGRG的表征45-47
• 2. NGR靶向材料用量的篩選47-48
• 2.1 NGR靶向材料用量對脂質(zhì)體包封率的影響47
• 2.2 NGR靶向材料用量對脂質(zhì)體的細胞攝取的影響47-48
• 3. NGR修飾的多西他賽pH敏感長循環(huán)脂質(zhì)體的制備與評價48-50
• 3.1 DTX/NGR-PLL的重現(xiàn)性實驗48-49
• 3.2 DTX/NGR-PLL的外觀形態(tài)49
• 3.3 DTX/NGR-PLL的粒徑分布及Zeta電勢49-50
• 4. DTX/NGR-PLL的體外釋放實驗50-52
• 5. DTX/PLL和DTX/NGR-PLL的穩(wěn)定性研究52-53
• 三、討論53-55
• 第三章 多西他賽脂質(zhì)體藥物動力學研究55-65
• 一、儀器與試劑55
• 1. 儀器55
• 2. 試劑55
• 3. 動物55
• 二、方法與結(jié)果55-63
• 1. 血漿樣品的預(yù)處理55-56
• 2. 血漿樣品測定方法的建立56-61
• 2.1 色譜條件56
• 2.2 方法專屬性實驗56-57
• 2.3 最低檢測限和最低定量限57
• 2.4 標準曲線的建立57-58
• 2.5 精密度實驗58-59
• 2.6 方法提取回收率實驗59-60
• 2.7 測定方法回收率實驗60-61
• 3. 多西他賽溶液及脂質(zhì)體的藥物動力學評價61-63
• 3.1 血藥濃度的測定61-62
• 3.2 藥代動力學參數(shù)的計算62-63
• 三、討論63-65
• 第四章 DTX/PLL和DTX/NGR-PLL的體內(nèi)外的靶向性研究65-80
• 一、儀器與試劑65-66
• 1. 儀器65
• 2. 試劑65
• 3. 細胞與動物65-66
• 二、方法與結(jié)果66-78
• 1. 細胞培養(yǎng)66
• 1.1 細胞復蘇與凍存66
• 1.2 細胞的傳代66
• 2. 空白脂質(zhì)體的細胞毒性試驗66-68
• 3. DTX/PLL和DTX/NGR-PLL的細胞毒性實驗68-71
• 3.1 MCF-7的細胞毒性實驗69-70
• 3.2 HT-1080的細胞毒性實驗70-71
• 4. 細胞攝取實驗71-75
• 4.1 定性細胞攝取實驗71-73
• 4.2 定量細胞攝取實驗73-75
• 5. 荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤靶向性試驗75-77
• 6. 體內(nèi)初步安全性評價77-78
• 三、討論78-80
• 全文結(jié)論80-82
• 參考文獻82-89
• 致謝89-90
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文90-91
• 學位論文評閱及答辯情況表91

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