本文關(guān)鍵詞：NGR修飾的多西他賽pH敏感長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的研究

  更多相關(guān)文章： 多西他賽 腫瘤靶向 pH敏感 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體 NGR

【摘要】：多西他賽自臨床應(yīng)用以來(lái),治療腫瘤的效果顯著,上市制劑的臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛,但其胃腸道和血液系統(tǒng)毒性、過(guò)敏反應(yīng)等毒副作用,影響臨床治療,給患者帶來(lái)痛苦。因此通過(guò)新型的藥物遞送系統(tǒng)的研究,進(jìn)一步提高藥物的治療指數(shù),降低毒副作用,是目前相關(guān)研究的熱點(diǎn)之一。在藥物遞送系統(tǒng)的研究中,通過(guò)納米材料、生物技術(shù)和物理化學(xué)等理論設(shè)計(jì)腫瘤靶向脂質(zhì)體,從而進(jìn)一步提高藥物療效,降低毒副作用,是研究的重要方向。普通脂質(zhì)體由于易被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬并清除而難以進(jìn)入腫瘤組織,聚乙二醇修飾的脂質(zhì)體延長(zhǎng)其在血液中的滯留時(shí)間,容易透過(guò)腫瘤組織的毛細(xì)血管,更有效地在腫瘤部位滲漏和聚集。利用靶向腫瘤本身及腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上的某些受體的多肽對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾,能夠進(jìn)一步增強(qiáng)制劑的靶向性,降低毒副作用。本課題在普通pH敏感脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上,制備被動(dòng)和主動(dòng)腫瘤靶向相結(jié)合的NGR修飾的多西他賽pH敏感長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體：通過(guò)聚乙二醇(PEG)修飾達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)功能,減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬和清除,提高制劑體內(nèi)穩(wěn)定性；采用腫瘤靶向多肽NGR進(jìn)行修飾,使脂質(zhì)體能夠主動(dòng)靶向至腫瘤部位,提高藥物在腫瘤組織的聚集量：利用琥珀酸膽固醇單酯(CHEMS)的pH敏感機(jī)制靶向釋放藥物,共同實(shí)現(xiàn)靶向遞送和控制釋放的功能。本文通過(guò)處方篩選制備了多西他賽pH敏感長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(DTX/PLL)和NGR修飾的多西他賽pH敏感長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(DTX/NGR-PLL),研究脂質(zhì)體的理化性質(zhì)和體外釋放特性,并考察了脂質(zhì)體的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和體內(nèi)外腫瘤靶向性。主要研究方法與結(jié)果如下：1. DTX/PLL的制備與評(píng)價(jià)采用HPLC測(cè)定多西他賽的含量,建立測(cè)定脂質(zhì)體包封率的方法。在多西他賽pH敏感脂質(zhì)體處方研究的基礎(chǔ)上,以脂質(zhì)體包封率為指標(biāo),通過(guò)單因素篩選確定脂質(zhì)體中長(zhǎng)循環(huán)材料CHEMS-PEG2000的用量。結(jié)果表明長(zhǎng)循環(huán)材料的用量為磷脂酰乙醇胺(PE)的5%時(shí)包封率最高,包封率為71.88+0.99%,為最優(yōu)處方。按照最優(yōu)處方制備脂質(zhì)體,并對(duì)其進(jìn)行考察,結(jié)果表明所制脂質(zhì)體外觀形態(tài)良好,粒徑為192.54±7.73 μm,Zeta電勢(shì)為-27.9±0.9 mV。為研究脂質(zhì)體釋放的pH敏感特性,在不同pH釋放介質(zhì)中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn),測(cè)定不同制劑的體外釋藥特征。結(jié)果表明與多帕菲@相比DTX/PLL在pH7.4介質(zhì)中較穩(wěn)定,72 h時(shí)累計(jì)釋放率達(dá)到81.88%,證明其具有緩釋功能：而在pH5.0介質(zhì)中DTX/PLL釋放加快,48 h時(shí)累計(jì)釋放率為85.50%,證明了其pH敏感的體外釋放特性。2. DTX/NGR-PLL的制備與評(píng)價(jià)為進(jìn)一步提高脂質(zhì)體的腫瘤靶向性,通過(guò)在脂質(zhì)體表面飾靶向多肽實(shí)現(xiàn)腫瘤的主動(dòng)靶向。設(shè)計(jì)合成具有氨肽酶(CD13)受體靶向的多肽NGR的CHEMS-PEG2000-GNGRG聚合物,以脂質(zhì)體包封率、細(xì)胞熒光攝取強(qiáng)度為指標(biāo),在DTX/PLL的基礎(chǔ)上進(jìn)行處方篩選,確定DTX/NGR-PLL的最優(yōu)處方中靶向材料用量為PE的0.8%；最優(yōu)處方所制脂質(zhì)體脂質(zhì)體外觀形態(tài)良好,粒徑為202.34±7.40 nm,Zeta電勢(shì)為-25.7±2.9 mV；體外釋放實(shí)驗(yàn)表明,NGR修飾后的脂質(zhì)體DTX/NGR-PLL中藥物釋放行為與未修飾的脂質(zhì)體DTX/PLL相似,DTX/NGR-PLL在pH7.4介質(zhì)中72 h時(shí)累計(jì)釋放率為81.58%,而在pH5.0介質(zhì)中脂質(zhì)體48 h時(shí)累計(jì)釋放率為89.39%,證明其緩釋及pH敏感特性；初步穩(wěn)定性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中,室溫(25℃C)條件下保存3周、低溫4℃冰箱中6周,脂質(zhì)體溶液的外觀性狀、粒徑和EE的變化不大,穩(wěn)定性較好。3.藥物動(dòng)力學(xué)研究為評(píng)價(jià)脂質(zhì)體的體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)功能,本部分以多帕菲@和普通pH敏感脂質(zhì)體(DTX/PSL)作為對(duì)照制劑,考察DTX/PLL和DTX/NGR-PLL在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性。DTX/PLL和DTX/NGR-PLL在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度較多帕菲@和DTX/PSL溶液組明顯提高,AUC0-∞值都顯著增大,DTX/PLL和DTX/NGR-PLL(AUC0-∞=41.521和AUC0-∞=46.430),較Duopafei(?)(AUC0-∞=12.290)和DTX-PSL(AUC0-∞=28.749)組明顯提高,與普通脂質(zhì)體(DTX/PSL)相比,PEG修飾的兩種長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(DTX/NGR-PLLDTX/PLL)在大鼠體內(nèi)的滯留時(shí)間(MRT)更加延長(zhǎng),MRT0-∞:DTX/NGR-PLL DTX/PLLDTX/PSL,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DTX/PLL和DTX/NGR-PLL均可明顯延長(zhǎng)藥物的MRT,具有顯著的體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)的作用。4.體內(nèi)、外的靶向性研究通過(guò)MCF-7[CD13(-)]和HT-1080細(xì)胞[CD13(+)]考察脂質(zhì)體的體外腫瘤靶向性。MTT法測(cè)定的細(xì)胞毒性結(jié)果表明DTX/PLL和DTX/NGR-PLL的抗腫瘤活性較游離藥物明顯增強(qiáng),IC50值均降低,且DTX/NGR-PLL對(duì)HT-1080的細(xì)胞毒性較DTX/PLL明顯增強(qiáng)；細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中兩種細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取較游離溶液明顯增強(qiáng),兩種細(xì)胞對(duì)兩種制劑攝取的不同,驗(yàn)證了脂質(zhì)體中NGR多肽的靶向作用。熒光探針標(biāo)記的脂質(zhì)體在荷瘤裸鼠腫瘤組織的熒光切片實(shí)驗(yàn)表明,兩種脂質(zhì)體均能成功靶向至腫瘤組織,靶向肽修飾后的靶向效果更明顯,證明DTX/NGR-PLL在體內(nèi)具有較強(qiáng)的腫瘤靶向能力。給藥組小鼠組織、切片表明,DTX/NGR-PLL脂質(zhì)體具有良好的安全性,對(duì)主要器官無(wú)明顯毒性。本文合成了NGR修飾的靶向材料,通過(guò)篩選制備了DTX/PLL和DTX/NGR-PLL,所制脂質(zhì)體外觀良好,粒徑均勻,體外釋放實(shí)驗(yàn)證明了脂質(zhì)體的pH敏感特性,大鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)作用,體內(nèi)外靶向性實(shí)驗(yàn)證明了腫瘤的靶向性。
【關(guān)鍵詞】：多西他賽 腫瘤靶向 pH敏感 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體 NGR
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R943
【目錄】：

• 中文摘要10-13
• ABSTRACT13-16
• 符號(hào)說(shuō)明16-18
• 前言18-24
• 第一章 多西他賽pH敏感長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的研究24-44
• 一、儀器與試劑24
• 1. 儀器24
• 2. 試劑24
• 二、方法與結(jié)果24-42
• 1. 多西他賽測(cè)定方法的建立24-29
• 1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定24-25
• 1.2 色譜條件25
• 1.3 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)25-26
• 1.4 定量限及檢測(cè)限的考察26
• 1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制26-27
• 1.6 精密度實(shí)驗(yàn)27-28
• 1.7 回收率實(shí)驗(yàn)28-29
• 2. 包封率與載藥量測(cè)定方法的建立29-32
• 2.1 方法回收率30-31
• 2.2 加樣回收率31-32
• 3. 多西他賽pH敏感長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體中CHEMS-PEG_(2000)用量的篩選32
• 4. 多西他賽pH敏感長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的制備與評(píng)價(jià)32-34
• 4.1 DTX/PLL的制備重現(xiàn)性考察32-33
• 4.2 DTX/PLL的外觀形態(tài)33
• 4.3 DTX/PLL的粒徑分布及Zeta電勢(shì)33-34
• 5. 多西他賽pH敏感長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的體外釋放實(shí)驗(yàn)34-42
• 5.1 多西他賽體外釋放實(shí)驗(yàn)高效液相色譜分析方法的建立34-39
• 5.2 藥物和DTX/PLL的體外釋放曲線39-42
• 三、討論42-44
• 第二章 NGR修飾的多西他賽pH敏感長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的研究44-55
• 一、儀器與試劑44
• 1. 儀器44
• 2. 試劑44
• 二、方法與結(jié)果44-53
• 1. CHEMS-PEG_(2000)-GNGRG的合成與表征44-47
• 1.1 CHEMS-PEG_(2000)-GNGRG的合成44-45
• 1.2 CHEMS-PEG_(2000)-GNGRG的表征45-47
• 2. NGR靶向材料用量的篩選47-48
• 2.1 NGR靶向材料用量對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響47
• 2.2 NGR靶向材料用量對(duì)脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取的影響47-48
• 3. NGR修飾的多西他賽pH敏感長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的制備與評(píng)價(jià)48-50
• 3.1 DTX/NGR-PLL的重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)48-49
• 3.2 DTX/NGR-PLL的外觀形態(tài)49
• 3.3 DTX/NGR-PLL的粒徑分布及Zeta電勢(shì)49-50
• 4. DTX/NGR-PLL的體外釋放實(shí)驗(yàn)50-52
• 5. DTX/PLL和DTX/NGR-PLL的穩(wěn)定性研究52-53
• 三、討論53-55
• 第三章 多西他賽脂質(zhì)體藥物動(dòng)力學(xué)研究55-65
• 一、儀器與試劑55
• 1. 儀器55
• 2. 試劑55
• 3. 動(dòng)物55
• 二、方法與結(jié)果55-63
• 1. 血漿樣品的預(yù)處理55-56
• 2. 血漿樣品測(cè)定方法的建立56-61
• 2.1 色譜條件56
• 2.2 方法專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)56-57
• 2.3 最低檢測(cè)限和最低定量限57
• 2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立57-58
• 2.5 精密度實(shí)驗(yàn)58-59
• 2.6 方法提取回收率實(shí)驗(yàn)59-60
• 2.7 測(cè)定方法回收率實(shí)驗(yàn)60-61
• 3. 多西他賽溶液及脂質(zhì)體的藥物動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)61-63
• 3.1 血藥濃度的測(cè)定61-62
• 3.2 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算62-63
• 三、討論63-65
• 第四章 DTX/PLL和DTX/NGR-PLL的體內(nèi)外的靶向性研究65-80
• 一、儀器與試劑65-66
• 1. 儀器65
• 2. 試劑65
• 3. 細(xì)胞與動(dòng)物65-66
• 二、方法與結(jié)果66-78
• 1. 細(xì)胞培養(yǎng)66
• 1.1 細(xì)胞復(fù)蘇與凍存66
• 1.2 細(xì)胞的傳代66
• 2. 空白脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性試驗(yàn)66-68
• 3. DTX/PLL和DTX/NGR-PLL的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)68-71
• 3.1 MCF-7的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)69-70
• 3.2 HT-1080的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)70-71
• 4. 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)71-75
• 4.1 定性細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)71-73
• 4.2 定量細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)73-75
• 5. 荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤靶向性試驗(yàn)75-77
• 6. 體內(nèi)初步安全性評(píng)價(jià)77-78
• 三、討論78-80
• 全文結(jié)論80-82
• 參考文獻(xiàn)82-89
• 致謝89-90
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文90-91
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表91

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