本文關(guān)鍵詞：二硫氨基甲酸肽吡咯烷抑制大鼠角膜新生血管形成的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究背景 角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)是多種眼表疾病如感染性角膜炎、眼化學(xué)傷、熱燒傷、非感染性角膜變性的重要特征之一,也是角膜移植術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)的高危因素,是導(dǎo)致角膜盲的主要原因之一,角膜新生血管的防治對于治療眾多角膜疾病和預(yù)防角膜盲具有重大意義。 一直以來,眾多研究人員致力于角膜新生血管發(fā)病機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究,試圖從發(fā)病機(jī)制上預(yù)防或治療角膜新生血管,遺憾的是到目前為止,其確切發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。目前治療角膜新生血管的藥物主要有類固醇激素、非甾體抗炎藥物、抗VEGF藥物、環(huán)孢霉素類藥物,但這些藥物多存在局部或全身毒副作用或者價格昂貴等不足。 二硫氨基甲酸肽吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamte,PDTC)是核因子-κB(muclear factor-KappaB,NF-κB)活化的特異性阻斷劑。近年的研究發(fā)現(xiàn),NF-κB在非激活情況下,主要以p50/p65二聚體與NF-κB抑制單位IκB形成的三聚體化合物存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外刺激時,IκB發(fā)生磷酸化及降解,激活的NF-κB(p50/p65二聚體)得以從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核,從而促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞因子及免疫基因的轉(zhuǎn)錄,在眼科疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起著重要的作用。目前研究表明,PDTC在增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管、腫瘤等疾病的治療中起著一定的作用。但是PDTC對角膜新生血管的作用少有報道,且PDTC抑制新生血管增生的具體機(jī)制尚不明確。 因此,本課題以PDTC為研究對象,采用縫線誘導(dǎo)法建立大鼠角膜新生血管模型,觀察不同濃度PDTC對大鼠角膜新生血管的影響,篩選PDTC眼部作用的安全有效濃度；通過免疫組織化學(xué)方法檢測在PDTC藥物作用過程中p65、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在新生血管化角膜中的表達(dá),探討其可能機(jī)制,為臨床對角膜新生血管的治療提供一定的參考。 第一部分觀察不同濃度PDTC對大鼠角膜新生血管作用的研究目的 觀察局部應(yīng)用不同濃度PDTC滴眼液對縫線誘導(dǎo)的大鼠角膜新生血管的影響,探討PDTC的有效安全濃度。 方法 配制相應(yīng)濃度PDTC滴眼液(1mg/ml,2mg/ml,4mg/ml)。將48只健康成年雌性SD大鼠隨機(jī)分成四組,均設(shè)定以右眼為實(shí)驗(yàn)眼。建立縫線誘導(dǎo)大鼠角膜新生血管模型,并隨機(jī)分為A組(lmg/ml PDTC滴眼組),B組(2mg/ml PDTC滴眼組),C組(4mg/ml PDTC滴眼組),D組(PBS滴眼組)。各組均于右眼角膜縫線術(shù)后第1天開始使用相應(yīng)不同濃度的滴眼液,每日4次,每次10μl。自縫線術(shù)后第1天開始,每日于裂隙燈顯微鏡下觀察各組大鼠角膜新生血管生長情況,于第5、7、14、21天每組隨機(jī)抽取3只大鼠測量CNV長度,運(yùn)用公式計(jì)算CNV面積并攝影記錄。術(shù)后第14天,每組隨機(jī)抽取3只大鼠行角膜組織病理學(xué)檢查：腹腔注射麻醉,采用頸椎脫臼法處死,手術(shù)顯微鏡下摘除右眼眼球,剪下角膜組織,4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋,做4μm連續(xù)切片,常規(guī)蘇木精-伊紅染色,以中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。 結(jié)果 1.不同時間點(diǎn)各組CNV面積(mm2):A、B、C組角膜新生血管面積在各時間點(diǎn)均明顯小于D組(P0.01)。第5天時,A、B、C組之間兩兩相比無明顯差異(P0.05)；第7天時,A組角膜新生血管面積較B、C組密集,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),B組與C組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.1)；第14天時,A組角膜新生血管面積大于B、C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),B組與C組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.1)；術(shù)后第14天至術(shù)后第21天,各組角膜新生血管生長面積變化不明顯,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.1)。 2.組織病理學(xué)觀察：第14天,A組可見角膜基質(zhì)層變厚,結(jié)構(gòu)紊亂,較密集新生血管管腔,管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞附著,全層角膜較密集炎性細(xì)胞浸潤；B組可見角膜基質(zhì)層結(jié)構(gòu)整齊,少許新生血管管腔,角膜內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤；C組角膜基質(zhì)層結(jié)構(gòu)較整齊,新生血管管腔稀疏,角膜全層炎性細(xì)胞浸潤少；D組角膜水腫增厚,基質(zhì)層結(jié)構(gòu)不清,大量新生血管管腔,管腔內(nèi)可見充滿紅細(xì)胞,角膜全層見密集炎性細(xì)胞浸潤。 結(jié)論 大鼠角膜縫線術(shù)后局部應(yīng)用1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml濃度PDTC滴眼液有抑制角膜新生血管的作用；2mg/ml PDTC滴眼液為抑制角膜新生血管的有效安全濃度。 第二部分PDTC抑制大鼠角膜新生血管作用的機(jī)制研究 目的 觀察局部應(yīng)用2mg/ml PDTC滴眼液對縫線誘導(dǎo)的大鼠角膜新生血管的抑制作用,檢測新生血管化大鼠角膜組織中p65、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá),并探討其意義。方法 65只健康成年雌性SD大鼠,隨機(jī)抽取5只作為正常對照組,其余60只隨機(jī)分為A組(2mg/ml PDTC組)、B組(0.1%地塞米松磷酸鈉組)、C組(PBS對照組),每組20只。正常對照組不處理,其余實(shí)驗(yàn)動物制作大鼠右眼角膜縫線模型,術(shù)后分別予2mg/mlPDTC、0.1%地塞米松磷酸鈉、PBS緩沖液點(diǎn)右眼,每日4次,每次10μl,連續(xù)21天。術(shù)后每天在裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠角膜新生血管及縫線的變化,在角膜縫線術(shù)后第5、7、14、21天分別隨機(jī)抽取5只大鼠計(jì)算各組角膜新生血管面積并攝影記錄；于第14天隨機(jī)取每組5只大鼠,處死后取右眼角膜組織進(jìn)行角膜組織病理切片觀察及免疫組織化學(xué)方法檢測角膜組織中p65、VEGF和TNF-α的表達(dá)。每張切片隨機(jī)取5個200倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)并拍照,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用neans±S.D.表示,各組CNV面積比較用重復(fù)測量設(shè)計(jì)資料的方差分析(Reeated Measure ANOVA)；p65.VECF和TNF-α的表達(dá)量用單向方差分析(One-Way ANOVA),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.不同時間點(diǎn)各組CNV面積(mm2)：A組2mg/ml PDTC組、B組0.1%地塞米松磷酸鈉組在5、7、14、21天角膜新生血管面積分別為(5.66±1.07mm2,5.82±1.28mm2)；(11.96±1.87mm2,10.78±2.02mm2)；(13.16±2.35mm2,14.97±1.52mm2):(14.39±2.35mm2,14.98±2.02mm2),各時間點(diǎn)兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。C組PBS對照組在5、7、14、21天角膜新生血管面積分別為(12.96±2.12mm2)；(21.45±2.78mm2)；(32.34±2.54mm2)；(34.12±1.73mm2),各時間點(diǎn)新生血管面積大于A組與B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 2.組織病理學(xué)觀察：大鼠角膜縫線術(shù)后第14天,正常角膜可見角膜組織結(jié)構(gòu)清晰,上皮細(xì)胞層排列整齊,角膜基質(zhì)層膠原纖維排列規(guī)則,內(nèi)皮層單層扁平細(xì)胞排列有序；A組可見角膜組織結(jié)構(gòu)較整齊,角膜基質(zhì)層散在新生血管形成,管腔較小,腔內(nèi)少量紅細(xì)胞,少量淋巴細(xì)胞浸潤；B組角膜組織結(jié)構(gòu)趨于完整,實(shí)質(zhì)層散在新生血管,少量淋巴細(xì)胞浸潤；C組角膜實(shí)質(zhì)層膠原基質(zhì)腫脹,板層間隙增寬,基質(zhì)內(nèi)較密集新生薄壁血管,以中前部為多,管腔內(nèi)見較多紅細(xì)胞,角膜實(shí)質(zhì)層大量淋巴細(xì)胞浸潤。 3.p65.VEGF和TNF-α免疫組織化學(xué)圖像分析：活化的NF-κB主要在細(xì)胞核中以p65形式表達(dá),VEGF和TNF-a表達(dá)于胞膜胞漿中。正常對照眼無新生血管,p65、VEGF和TNF-a僅在角膜上皮層和基質(zhì)層有少量微弱的表達(dá)；大鼠角膜縫線術(shù)后第14天,A組、B組新生血管稀少,p65、VEGF和TNF-α在角膜上皮層、內(nèi)皮層及基質(zhì)層少量表達(dá)；C組新生血管密度增高,p65、VEGF和TNF-α表達(dá)增多。在各組可觀察到p65的表達(dá)強(qiáng)度與VEGF和TNF-α的表達(dá)強(qiáng)度有著明顯的一致性。 4.p65、VEGF和TNF-α免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：術(shù)后14天,各組角膜p65、VEGF和TNF-α陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明,各組間p65、VEGF和TNF-α的表達(dá)不全相等,A、B、C組較正常角膜組陽性細(xì)胞數(shù)增多有顯著性差異(P0.05),C組p65、VEGF和TNF-α的表達(dá)相對A、B組較高(P0.05),但A、B組間比較,角膜p65、VEGF和TNF-α的表達(dá)無明顯差異(P0.1)。 結(jié)論 局部應(yīng)用PDTC滴眼劑抑制角膜血管新生的機(jī)制可能與減少細(xì)胞核中p65的表達(dá),降低新生血管化大鼠角膜中VEGF和TNF-α的表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：角膜 新生血管 二硫氨基甲酸肽吡咯烷 核因子-κB 血管內(nèi)皮生長因子 腫瘤壞死因子-α
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R772.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 第一部分 觀察不同濃度PDTC對大鼠角膜新生血管作用的研究20-34
• 1 材料20-22
• 2 方法22-24
• 3 結(jié)果24-29
• 4 討論29-34
• 第二部分 PDTC抑制大鼠角膜新生血管作用的機(jī)制研究34-49
• 1 材料34-36
• 2 方法36-39
• 3 結(jié)果39-45
• 4 討論45-49
• 全文總結(jié)與展望49-50
• 參考文獻(xiàn)50-57
• 綜述57-68
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文68-69
• 致謝69-70

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：988901