本文關(guān)鍵詞：EBV感染相關(guān)的豬鼻咽癌模型的構(gòu)建

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【摘要】：愛(ài)波斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是γ皰疹病毒家族成員,屬DNA病毒,人類是它的宿主,并且一旦感染終身攜帶。在全世界的成年人中EBV感染率很高,EBV感染與傳染性單核細(xì)胞增多癥、Burkitt's淋巴瘤、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)、免疫缺陷病人的B細(xì)胞淋巴瘤和胃癌等多種良性和惡性疾病有關(guān),EBV感染外周血B淋巴細(xì)胞可以導(dǎo)致其永生化和不斷增殖。EBV感染分為潛伏感染和溶細(xì)胞感染兩種狀態(tài),潛伏感染狀態(tài)是以表達(dá)一系列EBV潛伏感染蛋白為特征,其中包括6個(gè)核蛋白(EBNA1、 EBNA2、 EBNA3A,3B,3C和EBNA-LP)、3個(gè)潛伏膜蛋白(LMP1、LMP2A和B)、2個(gè)小核RNA(EBER1和2),以及Bam HI-A轉(zhuǎn)錄區(qū)等共12個(gè)EBV基因編碼蛋白。EBV與多種人類上皮性腫瘤有關(guān),其中與鼻咽癌的關(guān)系最密切,鼻咽癌中EBV陽(yáng)性率達(dá)到90%～100%。 EBV的潛伏膜蛋白基因1(latent membrane protein1,LMP1)是最重要的病毒基因產(chǎn)物之一,它不僅在潛伏感染狀態(tài)時(shí)表達(dá),而且也在EBV溶細(xì)胞循環(huán)狀態(tài)中大量表達(dá)。已知LMP1是唯一被證實(shí)的EB病毒基因編碼的癌基因,它是由一個(gè)短的氨基末端的細(xì)胞內(nèi)區(qū)、六個(gè)疏水的跨膜區(qū)和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)梭基末端構(gòu)成的完整的膜蛋白。研究顯示,LMP1在結(jié)構(gòu)上與腫瘤壞死因子受體家族的CD40類似,具有激活物受體特征,LMP1可以和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡區(qū)域(TRAD)蛋白結(jié)合；LMP1梭基末端具有生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化功能,在EBV誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。從鼻咽癌組織中獲得的EBV LMP1基因(N-LMP1)與標(biāo)準(zhǔn)的B95-8細(xì)胞來(lái)源的LMP1基因(B-LMP1)序列存在一定的差異。與標(biāo)準(zhǔn)株LMP1基因比較,N-LMP1的致瘤性更強(qiáng),它的主要特征是在其3’端存在一段30bp核苷酸的缺失及33bp重復(fù)序列的增多。 EBV感染B淋巴細(xì)胞的途徑已十分清楚,B細(xì)胞表面存在EB病毒受體人補(bǔ)體受體2(complement component receptor2，CR2),CR2原為補(bǔ)體C3d的受體,因EB病毒主要?dú)つぬ堑鞍譯p350/220的分子結(jié)構(gòu)與C3d高度相似,故可經(jīng)過(guò)該受體進(jìn)入細(xì)胞。然而,EB病毒如何進(jìn)入上皮細(xì)胞,其機(jī)制至今未明,可能通過(guò)以下途徑：(1)通過(guò)與上皮細(xì)胞表面的CR2受體結(jié)合或作為免疫復(fù)合物的一部分與上皮細(xì)胞的免疫球蛋白受體相結(jié)合而進(jìn)入被感染細(xì)胞；(2)通過(guò)產(chǎn)病毒細(xì)胞與上皮細(xì)胞間的直接接觸或與粘膜細(xì)胞融合而感染上皮細(xì)胞；(3)在輔助因子／輔受體的幫助下感染細(xì)胞,或在輔病毒的幫助下轉(zhuǎn)變?yōu)槟芨腥旧掀ぜ?xì)胞的假型；目前受體學(xué)說(shuō)支持率最高,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為EBV是通過(guò)上皮細(xì)胞表面的受體而得以進(jìn)入細(xì)胞的。雖然有關(guān)上皮細(xì)胞是否表達(dá)CR2至今仍有爭(zhēng)論,但已有多位研究者嘗試用不同的方法將CR2基因?qū)攵喾N細(xì)胞,所有研究均證實(shí),在提高細(xì)胞內(nèi)CR2表達(dá)水平后,EBV可成功感染原不能感染的細(xì)胞,或能明顯提高細(xì)胞對(duì)EBV的感染率。 EBV的ED-L2是EBV自身的啟動(dòng)子,ED-L2啟動(dòng)子是早期細(xì)胞裂解啟動(dòng)子,位于BNLF2(LMP2)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開(kāi)放讀碼框的上游,緊鄰BNLF1(LMPl)開(kāi)放讀碼框的下游,位于EBV-BNLF-2A短開(kāi)放讀碼框5’端和LMP1基因開(kāi)放讀碼框(LMP1)3’非翻譯區(qū)內(nèi),是具有嗜角質(zhì)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子。當(dāng)含有LMP1片段的EBV基因編碼在ED-L2啟動(dòng)子的控制下時(shí),該基因?qū)⒈晦D(zhuǎn)錄并表達(dá)于舌、咽和食道等鱗狀上皮。在ED-L2啟動(dòng)子有一個(gè)CACACCC盒樣cis-調(diào)控組件,鋅指蛋白通過(guò)與該區(qū)域的特異性相互作用而調(diào)節(jié)ED-L2啟動(dòng)子活性。佛波脂就可通過(guò)一個(gè)鋅指蛋白依賴因子與CACACCC特異性相互作用而增強(qiáng)ED-L2啟動(dòng)子活性。 豬在解剖、組織、生理和營(yíng)養(yǎng)代謝、血液生化指標(biāo)、疾病發(fā)生過(guò)程等方面與人類極為相近,豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一個(gè)重要應(yīng)用是建立人類疾病模型。近年來(lái),手工克隆(handmade cloning,HMC)技術(shù)的發(fā)展大大推進(jìn)了豬作為人類疾病動(dòng)物模型的研究。手工克隆是一項(xiàng)不需要顯微操作,操作簡(jiǎn)單省時(shí)的核移植方法,該方法最早被應(yīng)用于牛的體細(xì)胞核移植,并且得到后代。HMC技術(shù)路線主要包括卵母細(xì)胞去透明帶,徒手切割半卵去核,雙半卵融合、激活,以及支持無(wú)透明帶卵／胚胎的培養(yǎng)體系；與常規(guī)核移植方法相比,HMC技術(shù)最大的特點(diǎn)是對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求相對(duì)而言不是太高,不需要顯微操作儀,而且對(duì)技術(shù)人員的要求也降低許多。運(yùn)用該技術(shù),豬作為人類疾病動(dòng)物模型已應(yīng)用在糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及眼科疾病等方面,但在有關(guān)鼻咽癌方面尚未見(jiàn)報(bào)道。 我們擬采用鼻咽癌來(lái)源的LMP1(N-LMP1)和CR2,分別利用泛表達(dá)啟動(dòng)子CMV和嗜鱗狀上皮啟動(dòng)子ED-L2與之構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬模型,以期實(shí)現(xiàn)N-LMP1和CR2在豬鼻咽上皮高水平表達(dá),從而誘發(fā)豬患上與EBV感染相關(guān)的鼻咽癌。本文進(jìn)行了如下研究： (一)轉(zhuǎn)基因豬胚胎成纖維細(xì)胞的構(gòu)建與鑒定PCR法分別擴(kuò)增出ED-L2、N-LMP1、CR2三個(gè)基因片段,以pNl-CMV為基礎(chǔ)載體,用Sma Ⅰ和Age Ⅰ雙酶切CR2基因后回收產(chǎn)物,與同樣酶切處理的pNl-CMV載體進(jìn)行連接,構(gòu)建PN1-CMV-CR2重組質(zhì)粒；用Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ雙酶切N-LMP1基因后回收產(chǎn)物,與同樣酶切處理的PN1-CMV-CR2載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài),卡那青霉素篩選培養(yǎng),PCR鑒定陽(yáng)性克隆后擴(kuò)繁提取質(zhì)粒,獲得表達(dá)載體PN1-CMV-N-LMP1-CR2,對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和DNA測(cè)序鑒定,結(jié)果符合預(yù)期；用Ase Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切ED-L2啟動(dòng)子后回收產(chǎn)物,與同樣酶切處理的PN1-CMV-N-LMP1-CR2載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài),卡那青霉素篩選培養(yǎng),PCR鑒定陽(yáng)性克隆后擴(kuò)繁提取質(zhì)粒,獲得表達(dá)載體PN1-ED-L2-N-LMP1-CR2,對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和DNA測(cè)序鑒定,結(jié)果符合預(yù)期；利用脂質(zhì)體法將兩種表達(dá)載體pNl-CMV-N-LMP1-CR2和PN1-ED-L2-N-LMP1-CR2分別轉(zhuǎn)染豬胚胎成纖維細(xì)胞系,經(jīng)過(guò)G418篩選,提取細(xì)胞基因組DNA,鑒定基因插入陽(yáng)性的細(xì)胞擴(kuò)繁,送手工克隆。 (二)轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建與鑒定卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)切卵、揀卵后,放入含有體外成熟(IVM)培養(yǎng)液的4孔板內(nèi),置于38.5℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。41-42h后,用透明質(zhì)酸酶將卵丘細(xì)胞和成熟的卵母細(xì)胞分離,用口吸管吸出卵母細(xì)胞,去除透明帶,切割能夠觀察到極體的卵母細(xì)胞,切除帶有極體部分的大約30%,每一個(gè)胞質(zhì)都放到含有融合液的融合槽中,調(diào)整參數(shù)至l00vDC、9us、2-4vAC,與單個(gè)體細(xì)胞一一配對(duì)融合。一個(gè)小時(shí)后,體細(xì)胞融合胞質(zhì)與用于二次融合的胞質(zhì)一一配對(duì)融合,此時(shí)調(diào)整參數(shù)至43vDC、80us、2-4vAC。此后將兩兩融合后的重構(gòu)胚轉(zhuǎn)移至IVC盤(pán)的加有化學(xué)激活劑的孔內(nèi),再將IVC盤(pán)放入38.5℃,5%CO2,5%02,90%N2三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)�；瘜W(xué)激活4-5h后,洗去激活劑,將重構(gòu)胚依個(gè)放入微穴培養(yǎng)孔中培養(yǎng),第六天將發(fā)育好的囊胚送去移植到受體母豬的子宮內(nèi),按常規(guī)飼養(yǎng)至分娩。共出生16頭巴馬小型豬,其中有8頭在出生兩周內(nèi)就死亡了,取全部豬的基因組DNA鑒定,已死亡的8頭小豬中有6頭陽(yáng)性,陽(yáng)性率為75%,其余8頭活豬無(wú)一陽(yáng)性,取了5頭死豬的舌、喉咽、會(huì)厭等部位HE染色,沒(méi)有觀察到組織異型增生。 本次實(shí)驗(yàn)我們共構(gòu)建了PN1-CMV-N-LMP1-CR2和PN1-ED-L2-N-LMP1-CR2兩個(gè)真核表達(dá)載體,其中去掉了N-LMP1的終止密碼子TAA,在N-LMP1和CR2之間增添了一段E2A序列GTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCAGGGCCC(在pGH-N-LMP1質(zhì)粒合成時(shí)已包含),使N-LMPl和CR2之間含有環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu),兩個(gè)目的基因翻譯后不會(huì)形成融合蛋白。載體經(jīng)過(guò)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證都與預(yù)期相符和。將兩個(gè)載體分別轉(zhuǎn)染了豬胚胎成纖維細(xì)胞,篩選出整合了N-LMP1和CR2雙基因的細(xì)胞系,利用篩選出的細(xì)胞系作為手工克隆的供體細(xì)胞,與卵母細(xì)胞融合,通過(guò)電激活和化學(xué)激活后產(chǎn)生的重構(gòu)胚移植到受體母豬的子宮內(nèi),受孕3個(gè)月后共生產(chǎn)出16頭小豬,有6頭是轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性,但較為遺憾的是,這6頭陽(yáng)性克隆豬均在2周內(nèi)死亡,沒(méi)來(lái)得及檢測(cè)RNA和蛋白質(zhì)水平是否表達(dá),HE染色豬舌、喉咽、會(huì)厭等部位均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)組織形態(tài)有異常,究其原因,可能有以下3點(diǎn)：1、目的基因沒(méi)有表達(dá)；2、目的基因表達(dá)了但由于豬存活時(shí)間短,沒(méi)能發(fā)現(xiàn)異型增生；3、取組織的部位不合適,導(dǎo)致沒(méi)能取到異型增生的組織。另一方面,豬死亡原因可能與基因重組、遺傳外重新編程、體細(xì)胞核移植本身、小型豬特殊的遺傳背景、基地飼養(yǎng)水平等有關(guān),具體原因仍需進(jìn)一步確定。本次實(shí)驗(yàn)雖然陽(yáng)性克隆豬沒(méi)有存活,但我們已經(jīng)將有關(guān)鼻咽癌的基因運(yùn)用到豬模型上,做了一次有意義的嘗試,同時(shí)也為以后建立豬鼻咽癌模型提供了一些有價(jià)值的材料和參考資料。
【關(guān)鍵詞】：EBV N-LMP1 CR2 鼻咽癌 豬胚胎成纖維細(xì)胞 手工克隆
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-16
• 前言16-23
• 實(shí)驗(yàn)流程圖23-24
• 第一章 轉(zhuǎn)基因豬胚胎成纖維細(xì)胞的構(gòu)建與鑒定24-57
• 1.1 節(jié)材料24-25
• 1.1.1 質(zhì)粒24
• 1.1.2 細(xì)菌24
• 1.1.3 細(xì)胞24
• 1.1.4 工具酶與主要試劑24-25
• 1.1.5 主要儀器25
• 1.2 節(jié)方法25-49
• 1.2.1 啟動(dòng)子ED-L2的克隆25-29
• 1.2.2 基因N-LMP1的克隆29-32
• 1.2.3 基因CR2的克隆32-37
• 1.2.4 ED-L2啟動(dòng)子特異性的鑒定37-39
• 1.2.5 pN1-CMV-N-LMP1-CR2和pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的構(gòu)建39-48
• 1.2.6 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建與鑒定48-49
• 1.3 節(jié)結(jié)果49-57
• 1.3.1 ED-L2、N-LMP1和CR2的擴(kuò)增49-50
• 1.3.2 ED-L2啟動(dòng)子特異性的鑒定結(jié)果50-51
• 1.3.3 pN1-CMV-N-LMP1-CR2載體的酶切鑒定結(jié)果51-52
• 1.3.4 pN1-ED-12-N-LMP1-CR2載體的酶切鑒定結(jié)果52-53
• 1.3.5 陽(yáng)性細(xì)胞克隆的篩選結(jié)果53-54
• 1.3.6 陽(yáng)性細(xì)胞克隆的鑒定結(jié)果54-57
• 第二章 轉(zhuǎn)基因豬的構(gòu)建與鑒定57-75
• 2.1 節(jié)材料57-58
• 2.1.1 細(xì)胞57
• 2.1.2 動(dòng)物57
• 2.1.3 主要試劑57-58
• 2.1.4 主要工具和儀器58
• 2.2 節(jié)方法58-67
• 2.2.1 卵母細(xì)胞采集和成熟58-61
• 2.2.2 克隆61-66
• 2.2.3 出生小豬DNA鑒定66-67
• 2.2.4 轉(zhuǎn)基因豬組織病理學(xué)檢查67
• 2.3 節(jié)結(jié)果67-75
• 2.3.1 出生小豬的DNA鑒定結(jié)果67-70
• 2.3.2 轉(zhuǎn)基因效率統(tǒng)計(jì)70
• 2.3.3 轉(zhuǎn)基因豬各種組織病理學(xué)檢測(cè)70-75
• 討論75-79
• 總結(jié)79-80
• 參考文獻(xiàn)80-87
• 英文縮寫(xiě)詞注釋87-88
• 成果88-89
• 致謝89-90

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 紀(jì)志武, 李保民，，曾毅;采用病毒受體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)建立EB病毒細(xì)胞感染模型[J];病毒學(xué)報(bào);1994年02期

2 藍(lán)軻,喬貴林,沈新民,張玲,呂麗春,姚開(kāi)泰;鼻咽癌來(lái)源潛伏膜蛋白1的表達(dá)誘發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠鼻咽不典型增生[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2002年05期

3 楊正田,沈偉,鄧?yán)^先;體細(xì)胞核移植胚胎核重編程的研究進(jìn)展[J];遺傳學(xué)報(bào);2004年06期

本文編號(hào)：980740