本文關(guān)鍵詞：喉癌microRNA差異表達譜的篩選及miR-125a抑制喉癌細胞增殖的研究

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【摘要】：背景與目的 喉癌是最常見的頭頸腫瘤之一,在呼吸道腫瘤中發(fā)病率居第二位,以鱗狀細胞癌為主,約占95%。隨著工業(yè)化的發(fā)展和空氣污染的加重,有調(diào)查表明,喉癌的發(fā)病率不斷升高,每年約增加25%,常見于中老年男性。2008年世界上男性喉癌發(fā)病率估計為5.1/100,000,男性病人死亡率約為2.2/100,000。根據(jù)最新的研究,雖然近30年來新的外科手術(shù)方法、化療藥物及更先進的放射治療手段已應用在喉癌的治療中,喉癌患者的總生存率不但并未得到提高,甚至有下降的趨勢,僅約50%,晚期喉癌的生存率更低達30～40%。 流行病學調(diào)查已確認喉癌的病因包括吸煙、酗酒、空氣污染、職業(yè)因素等。隨著分子生物學的迅猛發(fā)展,喉癌的發(fā)生發(fā)展已被證實是多基因、多步驟漸進發(fā)展的結(jié)果。尋找新的分子診斷標記物和治療靶點,實現(xiàn)腫瘤的個體化治療已成為當前腫瘤研究的重要方向之一。然而喉癌的分子發(fā)病機制目前仍未明確,目前還難以從分子水平干預喉癌的發(fā)病并提高其生存率。 微小RNAs (microRNAs, miRNAs)是一類長度大約19-25nt的進化保守、小分子單鏈非編碼RNA。miRNAs通過不完全或完全結(jié)合到靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3'untranslated region,3'UTR),從而降解靶基因mRNA或抑制其翻譯,實現(xiàn)對靶基因表達水平的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,從而參與調(diào)控個體發(fā)育、細胞代謝、增殖、分化和凋亡等多種生物學過程。盡管miRNAs只占整個基因組基因總數(shù)的2%左右,但是其調(diào)控的基因卻至少占基因組的30%,每個、miRNA可以控制數(shù)百個基因的表達,在基因組的調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。 近年越來越多的研究顯示,miRNAs可能作為癌基因或抑癌基因在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成的基因調(diào)控中扮演了重要角色。50%以上的miRNAs定位于已經(jīng)被證明與腫瘤相關(guān)的染色體區(qū)域,包括等位基因的雜合性丟失區(qū)、基因組斷裂點和脆性位點等。 有研究表明,miRNAs可能在喉癌等頭頸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,提示miRNA可能作為喉癌的生物標記物或治療靶標在喉癌的早期診斷、治療、預后等方面具有潛在的臨床價值。尋找新的診斷標記物和治療靶點是改善喉癌療效的關(guān)鍵,miRNAs研究為探索喉癌的發(fā)生發(fā)展機制、尋找新的診斷標記物和治療靶點提供了廣闊的前景。 然而,迄今為止喉癌的miRNA差異表達譜仍未明確�，F(xiàn)有的研究多為包括了口腔、咽、喉等多個部位的頭頸癌的差異表達譜,單獨喉癌的miRNAs差異表達譜研究非常少,而且不同研究間結(jié)果很不一致。為了避免把所有頭頸癌一起進行研究所可能帶來的偏倚,有必要單獨針對喉癌進行miRNAs差異表達譜的研究。 在腫瘤中表達增高的]miRNAs,可能具有癌基因的促進腫瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等功能；在腫瘤中表達下調(diào)的miRNAs,則可被認為具有抑癌基因的功能。差異表達的miRNAs的生物學功能一般必須通過體內(nèi)、體外實驗才能獲得證實。目前僅有少數(shù)miRNAs的功能得到了較深入的研究,miRNA在喉癌中的生物學功能研究則更罕見,亟待進一步研究。 本研究采用涵蓋了目前最新的miRbase數(shù)據(jù)庫中全部人類nicroRNA的第6代miRCURYTM LNA微陣列芯片,對喉癌中差異表達的miRNAs進行篩選,通過實時定量PCR對其進行驗證,并研究了miR-125a(即]miRNA-125a,又稱miR-125a-5p)對喉癌Hep2細胞增殖的影響。旨在為進一步研究miRNA與喉癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供線索,為尋找喉癌早期腫瘤分子標志物及后續(xù)的喉癌基因治療提供更有效的靶點,以便最終提高喉癌的早期診斷率并改善治療效果。 第一章利用基因芯片技術(shù)篩選喉癌組織中差異表達的miRNAs 研究目的 通過miRNA微陣列基因芯片技術(shù)研究喉癌組織與周圍正常喉黏膜之間差異表達的miRNAs,建立喉癌miRNA差異表達譜。 方法 從2010年開始收集在廣東省人民醫(yī)院耳鼻喉科進行喉癌手術(shù)的病人的組織和血標本,建立了喉癌標本庫。我們還建立并完善了標本的采集、處理、保存的標準化流程,并通過電腦軟件進行全面、準確的信息化管理。 在廣東省人民醫(yī)院喉癌標本庫中隨機選取了手術(shù)切除的喉癌組織及癌旁正常組織共10對采用最新的miRCURYTMNA微陣列基因芯片(Exiqon)進行分析：抽提總RNA,質(zhì)量鑒定合格后,對RNA進行熒光標記,芯片雜交,清洗掃描及信號數(shù)字化處理,掃描得到的圖像輸入GenePix Pro6.0(Axon)軟件進行坐標調(diào)整和數(shù)據(jù)提取。顯著差異表達的miRNAs通過火山圖(Volcano Plot)過濾后確認。使用MEV軟件(v4.6, TIGR)進行聚類分析。進一步采用芯片顯著性分析軟件(Significance analysis of microarrays, SAM, http://www-stat.stanford.edu/-tibs/sam/)對芯片數(shù)據(jù)進行分析,設定錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)為0.05。 結(jié)果 總RNA質(zhì)量鑒定結(jié)果：表明所有樣品總RNA的質(zhì)量可靠,沒有降解或DNA、蛋白質(zhì)污染,可入選進行下一步基因芯片等后續(xù)實驗。通過miRNA微陣列基因芯片初步篩選,結(jié)果經(jīng)過SAM軟件分析處理,獲得喉癌組織和癌旁正常組織之間顯著差異表達的microRNAs:相對正常喉黏膜,在喉癌組織中共有11個miRNAs表達顯著上調(diào)；114個miRNAs表達顯著下調(diào)。下調(diào)的miRNAs占大多數(shù)。 結(jié)論 1、喉癌與正常喉黏膜之間存在明顯差異表達的miRNAs,這些差異性表達的miRNAs可能在喉癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,可能成為新的喉癌分子標記物。 2、喉癌規(guī)范化標本庫的建立和信息化管理對于喉癌基礎研究非常重要,有助于保護珍貴醫(yī)學資源和提供高質(zhì)量喉癌標本。 第二章應用實時熒光定量PCR技術(shù)驗證喉癌組織中差異表達的miRNAs 研究目的 通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)進一步驗證基因芯片實驗中獲得喉癌組織中的差異表達的niRNAs。 方法 在廣東省人民醫(yī)院耳鼻喉科喉癌標本庫中隨機選取喉癌組織和癌旁正常喉黏膜配對標本32對標本進行莖環(huán)法qRT-PCR實驗,以U6為內(nèi)參,檢測let-7f-5p、 miR-10a-5p、miR-125a-5p(又稱miRNA-125a或miR-125a)、miR-144-3p. miR-195-5p、miR-203基因在32例喉癌病人的腫瘤及癌旁正常組織中的表達水平：提取標本的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,進行定量PCR擴增。對獲得的Ct值采用2-Δ△Ct法對基因表達進行相對定量。 結(jié)果 qRT-PCR實驗結(jié)果驗證了喉癌組織中的let-7f-5p、miR-10a-5p、miR-125a、 miR-144-3p、miR-195-5p、miR-203等的表達均顯著下調(diào),這6個miRNAs在32對喉癌與周圍正常喉黏膜組織之間的表達差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。miRNA定量PCR溶解曲線均為單一峰,說明PCR擴增特異性好。 結(jié)論 基因芯片與qRT-PCR結(jié)果一致,證實了miRNA微陣列基因芯片結(jié)果是真實可靠的。 第三章miR-125a抑制喉癌Hep2細胞株增殖的研究 研究目的 選取在基因芯片(?)qRT-PCR實驗中表達均顯著下調(diào)的miR-125a(又稱miR-125a-5p)作為研究對象。通過這一系列的體外細胞功能實驗研究miR-125a對喉癌Hep2細胞增殖的影響,以更好地了解在喉癌中miR-125a的生物學功能。 方法 合成：miR-125a模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor),并分別轉(zhuǎn)染至喉癌Hep2細胞株。實驗分為三組：陰性對照組(NC)、轉(zhuǎn)染miR-125a-mimic組、轉(zhuǎn)染miR-125a-inhibitor。應用MTT實驗、克隆形成和軟瓊脂集落形成實驗觀察miR-125a過表達或抑制對喉癌Hep2細胞增殖的影響；通過BrdU、流式細胞術(shù)等實驗分析miR-125a過表達或抑制對喉癌Hep2細胞周期的影響；采用Western blot技術(shù)檢測]miR-125a;對多個細胞周期調(diào)控因子的蛋白表達水平變化的影響。 結(jié)果 1、MTT實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-125a-mimic組Hep2細胞與對照組相比,活細胞數(shù)量明顯降低(P0.05),增殖能力受到顯著抑制；轉(zhuǎn)染miR-125a-inhibitor組Hep2細胞與對照組比較,活細胞數(shù)量明顯增加(P0.05),增殖能力受到顯著增強； 2、細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-125a-mimics組Hep2細胞克隆形成數(shù)目顯著低于NC組(P0.01)；而轉(zhuǎn)染]miR-125a-inhibitor組的克隆形成數(shù)目顯著高于NC組(P0.01)。說明miR-125a表達對喉癌Hep2細胞的增殖能力有顯著的抑制作用； 3、軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-125a-mimics組集落形成數(shù)明顯低于NC組(P0.01),而轉(zhuǎn)染]miR-125a-inhibitor組的集落形成數(shù)與NC組相比顯著增多(P0.01),提示miR-125a表達對喉癌細胞Hep2增殖能力有顯著的影響： 4、BrdU實驗結(jié)果顯示：喉癌Hep2細胞轉(zhuǎn)染miR-125a-mimics后,細胞處于S期的比例明顯低于NC組(P0.05),而轉(zhuǎn)染miR-125a-inhibitor組處于S期的細胞比例顯著高于NC組(P0.05)； 5、流式細胞術(shù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-125a后喉癌細胞G0/G1期增多,S期和G2/M期減少,說明腫瘤細胞出現(xiàn)G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變的阻滯,更多的細胞停滯在G0/G1期,細胞的增殖受到抑制；而轉(zhuǎn)染miR-125a-inhibitor后則出現(xiàn)喉癌細胞G0/G1期減少,S期和G2/M期增多,說明出現(xiàn)細胞周期進展,腫瘤細胞增殖增多； 6、Western blot技術(shù)分析了多個細胞周期調(diào)控因子在過表達miR-125a的喉癌Hep2細胞株中的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)cyclin D1、cyclin E的蛋白表達顯著下調(diào),p21、p27的蛋白表達顯著顯著上調(diào)。 結(jié)論 1、過表達miR-125a可抑制喉癌Hep2細胞株的增殖。 2、miR-125a可能通過影響多個細胞周期相關(guān)調(diào)控因子的表達,誘導細胞周期G0/G1期阻滯,從而抑制喉癌細胞增殖。
【關(guān)鍵詞】：喉癌 microRNAs 表達譜 增殖 細胞周期
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R739.65
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-21
• 第一章 利用基因芯片技術(shù)篩選喉癌組織中差異表達的miRNAs21-44
• 一、資料和方法21-25
• 二、結(jié)果25-39
• 三、討論39-44
• 第二章 應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對基因芯片結(jié)果進行驗證44-58
• 一、資料和方法44-48
• 二、結(jié)果48-51
• 三、討論51-58
• 第三章 miR-125a抑制喉癌Hep2細胞株增殖的研究58-80
• 一、資料和方法58-68
• 二、結(jié)果68-76
• 三、討論76-80
• 全文結(jié)論80-81
• 參考文獻81-88
• 縮略語表88-90
• 攻讀碩士學位期間成果90-92
• 致謝92-95
• 附件95

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 戴春富，，李德堅，文三立;喉癌組織中雌激素受體分布的臨床意義[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;1995年05期

2 李玉英，孫立群，谷京成;喉癌病人紅細胞免疫功能初探（摘要）[J];耳鼻咽喉-頭頸外科;1995年03期

3 白素娟;喉癌抑癌基因的研究進展[J];國外醫(yī)學.耳鼻咽喉科學分冊;1996年05期

4 王銀萍,杜寶東,郭曉峰,鐘李杰;喉癌和癌旁組織P_(53)蛋白的表達及臨床意義[J];白求恩醫(yī)科大學學報;1998年01期

5 劉隆躍,周天明,詹必武;手術(shù)治療喉癌根治性放療后復發(fā)病人13例報告[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;1998年11期

6 王衛(wèi)華;蘇鴻禧;;人類乳頭狀瘤病毒與喉癌[J];國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志;1991年05期

7 屠規(guī)益;各地腫瘤醫(yī)院喉癌收治情況[J];耳鼻咽喉-頭頸外科;1994年04期

8 ;激光治療喉癌[J];國外醫(yī)學.耳鼻咽喉科學分冊;1994年01期

9 程天風,黃秋生;喉癌切除喉成形術(shù)的護理體會[J];江蘇大學學報(醫(yī)學版);1994年02期

10 周健;手術(shù)治療喉癌88例分析[J];溫州醫(yī)學院學報;1995年S1期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李炯;段德民;鄭克孝;;新型非標記高通量microRNA芯片技術(shù)[A];第一屆全國生物物理化學會議暨生物物理化學發(fā)展戰(zhàn)略研討會論文摘要集[C];2010年

2 王俊峰;李巍;吳小江;阮康成;;大鼠附睪microRNA表達譜的研究[A];第十一次中國生物物理學術(shù)大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

3 蔣義國;劉斌斌;;毒理學中的microRNA研究[A];廣東省環(huán)境誘變劑學會、廣東省預防醫(yī)學會衛(wèi)生毒理專業(yè)委員會2010年學術(shù)會議資料匯編[C];2010年

4 鞏麗穎;孫開來;;兩種microRNA在先心病心肌組織中的表達[A];中國的遺傳學研究——遺傳學進步推動中國西部經(jīng)濟與社會發(fā)展——2011年中國遺傳學會大會論文摘要匯編[C];2011年

5 李夢龍;;Systematically analyze and select key features to microRNA precursors identification based on random forests[A];第十一屆全國計算（機）化學學術(shù)會議論文摘要集[C];2011年

6 徐晨;鮑堅強;李定;郭強蘇;;microRNA-449在小鼠精子發(fā)生過程中的作用研究[A];中國解剖學會2011年年會論文文摘匯編[C];2011年

7 江建霞;蔣晶晶;曹家樹;;白菜花粉發(fā)育及授粉受精過程相關(guān)microRNA篩選及驗證[A];中國園藝學會2011年學術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

8 劉娜;楊景華;張明方;;嫁接西瓜microRNA的鑒定以及表達差異研究[A];中國園藝學會2011年學術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

9 李鴻;屈晶晶;王睿;盛春君;程曉蕓;王吉影;蘇斌;柴尚玉;曲伸;;體外培養(yǎng)胰島的microRNA表達譜及功能研究[A];中華醫(yī)學會第十次全國內(nèi)分泌學學術(shù)會議論文匯編[C];2011年

10 王國坤;朱嘉琦;荊清;秦永文;;缺氧刺激影響心肌細胞釋放microRNA[A];第十三次全國心血管病學術(shù)會議論文集[C];2011年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊陽;喉癌與HP兩者存在聯(lián)系[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

2 秦皇島市腫瘤醫(yī)院放療科主任 趙成會;警惕喉癌的早期信號[N];河北科技報;2009年

3 劉江峰 趙成會;十個喉癌九個是煙民[N];衛(wèi)生與生活報;2009年

4 吳正虎;切除喉癌還能說話嗎？[N];浙江日報;2001年

5 黃志純　程守勤 （黃志純 南京中大醫(yī)院耳鼻咽喉科主任）;聲音嘶啞當心喉癌[N];健康報;2008年

6 陳默;中山“協(xié)和”“喉癌全切術(shù)”喜獲成功[N];中山日報;2008年

7 宋雯;舌、唇、喉癌的早期有什么信號[N];衛(wèi)生與生活報;2003年

8 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科 胡超蘇;早期喉癌不用切喉[N];健康時報;2009年

9 雄縣醫(yī)院耳鼻喉科 劉江峰;喉癌和肺心病 都是吸煙惹的禍[N];河北科技報;2009年

10 謝環(huán)馳;中國喉癌研究取得新突破[N];保健時報;2003年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王雷;胰管內(nèi)乳頭狀粘液性腫瘤：臨床特征與microRNA的差異表達[D];第二軍醫(yī)大學;2010年

2 崔熠;microRNA在砷致胚胎發(fā)育毒性中的作用機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

3 王鎮(zhèn);食管黏膜鱗狀上皮癌變相關(guān)microRNA的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

4 侯晉;microRNA在病毒感染和肝細胞癌中的作用及相關(guān)機制研究[D];清華大學;2010年

5 駱黎靜;人卵巢癌干細胞的分離、鑒定及其特異性microRNA的篩選[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

6 于曼麗;Let-7d對血管平滑肌細胞增殖調(diào)控的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2011年

7 陳勇;microRNA-200c在胃癌SGC7901/CDDP細胞中的作用及其機制的研究[D];河北醫(yī)科大學;2011年

8 于琦;雄激素受體在乳腺癌中表達意義和相關(guān)microRNA篩選的研究[D];天津醫(yī)科大學;2010年

9 翁春華;血管生成素特異microRNAs的鑒定與功能分析[D];浙江大學;2010年

10 袁圓;全腦缺血再灌注后大鼠海馬microRNA的變化及Let-7e調(diào)控Caspase-3表達和機制研究[D];浙江大學;2010年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 盧仲明;喉癌microRNA差異表達譜的篩選及miR-125a抑制喉癌細胞增殖的研究[D];南方醫(yī)科大學;2013年

2 宋永站;microRNA-200c對ZEB1表達影響及對腫瘤細胞侵襲遷移作用[D];江蘇大學;2010年

3 胡德亮;microRNA-19b在P19細胞向心肌細胞分化中的作用[D];南京醫(yī)科大學;2011年

4 曲婷;基于生物信息學方法的H1N1流感病毒致病及傳播特性研究[D];吉林大學;2010年

5 呂賽群;基于microRNA調(diào)控靶向腫瘤細胞的溶瘤腺病毒的研究[D];浙江理工大學;2010年

6 張秀梅;韌帶成纖維細胞成骨分化過程microRNA、mRNA和蛋白表達譜分析[D];濟南大學;2011年

7 孫佃臣;低磷脅迫響應microRNA及靶基因的克隆和大豆遺傳轉(zhuǎn)化研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2011年

8 吉娜;自發(fā)性高血壓大鼠肥厚心肌和纖維化腎臟組織中microRNA-21的表達[D];中國醫(yī)科大學;2010年

9 陳娟;靶向Livin的microRNA干擾對人卵巢癌細胞SKOV3體外作用的研究[D];河北醫(yī)科大學;2010年

10 梅林;卡氏肺孢子菌MSG-UCS基因microRNA表達載體的構(gòu)建和鑒定[D];重慶醫(yī)科大學;2010年

本文編號：972766