本文關(guān)鍵詞：31種廣東植物體外抗NPC活性的篩選及夾竹桃抗NPC作用和機(jī)制的初步研究

  更多相關(guān)文章： 鼻咽癌 腫瘤干細(xì)胞 夾竹桃

【摘要】：研究背景和目的： 鼻咽癌(NPC)是廣東省高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一,具有“廣東癌”之稱,易發(fā)生早期侵襲、轉(zhuǎn)移,目前鼻咽癌的治療以放療和化療為主[3-6],5年生存率維持在45-50%左右[6-10],且放化療后毒副作用大,還存在遠(yuǎn)期效果不明顯和耐藥性等問(wèn)題,因此,尋找有效的治療藥物對(duì)提高患者的生存期具有重要意義。本研究通過(guò)MTT法從31種廣東省植物提取物中初步檢測(cè)其抗鼻咽癌活性,通過(guò)分析比較他們的抗腫瘤活性大小后從這31種植物提取物中篩選出三種具有較強(qiáng)抗腫瘤活性植物提取物進(jìn)行鼻咽癌凋亡檢測(cè),以進(jìn)一步比較這三種提取物的抗鼻咽癌效果(這三種植物提取物分別是：夾竹桃、牛耳風(fēng)、牡荊)。通過(guò)分析比較從這三種植物提取物中篩選出一種最佳的抗鼻咽癌藥物--夾竹桃提取物,并對(duì)其抗鼻咽癌作用及機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。本研究在MTT法初步篩選具有抗鼻咽癌活性藥物時(shí)以肺癌A549細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。 方法： ①采用MTT法檢測(cè)31種來(lái)自于廣東的植物提取物對(duì)鼻咽癌增殖的影響,并以肺癌A549細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。分析比較各植物提取物的抗鼻咽癌活性大小后選出三種具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的植物提取物進(jìn)行鼻咽癌凋亡檢測(cè)。初步篩選出的三種植物提取物分別是：夾竹桃、牛耳風(fēng)、牡荊。 ②采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)夾竹桃、牛耳風(fēng)、牡荊三種植物提取物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響(PI和Annexin-V雙標(biāo)法)。通過(guò)分析比較從這三種植物提取物中篩選出一種最佳的抗鼻咽癌藥物,并對(duì)其抗鼻咽癌作用及機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。經(jīng)二重篩查后篩選出的最佳抗鼻咽癌藥物是：夾竹桃提取物。 ③采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)夾竹桃提取物對(duì)鼻咽癌及肺癌細(xì)胞集落形成能力(增殖能力)的影響。 ④側(cè)群細(xì)胞可作為腫瘤干細(xì)胞的新型代表,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)夾竹桃桃提取物對(duì)鼻咽癌側(cè)群(SP)細(xì)胞的影響。 ⑤腫瘤球含有腫瘤干細(xì)胞的多種特性,通過(guò)腫瘤球培養(yǎng)法(腫瘤球形成實(shí)驗(yàn))觀察夾竹桃提取物對(duì)腫瘤干細(xì)胞的影響,檢測(cè)夾竹桃桃提取物對(duì)鼻咽癌原代腫瘤球及第二代腫瘤球的效應(yīng)。 ⑥采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(WESTERN BLOT)檢測(cè)夾竹桃桃提取物抑制鼻咽癌的分子機(jī)制。 ⑦統(tǒng)計(jì)方法： 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用graph prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。三個(gè)及三個(gè)以上藥物濃度處理組的平板克隆形成數(shù)量、凋亡比例、側(cè)群比例、腫瘤球直徑、腫瘤球數(shù)量等數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較各組差異。。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： 一、MTT法初步比較31種植物提取物抗鼻咽癌活性大小。 MTT法初步檢測(cè)構(gòu)樹(shù)、水茄、鵝掌柴、豬屎豆、使君子、毛排錢樹(shù)、山芝麻、木荷、對(duì)葉蓉、南板蘭、馬蘭、鵲梅藤、龍須藤、醉魚(yú)草、石巖楓、五月艾、八角楓、峨眉唐松草、潺槁樹(shù)、土荊芥、山大顏、夾竹桃、牛耳風(fēng)、牡荊、金腰箭、含羞草、小葉榕、黃花捻、楊梅、龍船花、廣防風(fēng)等31種植物提取物的抗鼻咽癌活性。通過(guò)分析比較這31種植物提取物抗鼻咽癌活性大小后從中選出三種在小劑量藥物濃度下能顯著抑制鼻咽癌增殖的植物提取物,這三種植物提取物分別是：夾竹桃、牛耳風(fēng)、牡荊。 二、比較牛耳風(fēng)、牡荊、夾竹桃三種植物提取物抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞活性大小(以肺癌A549細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照)。 1、 MTT法比較：在通過(guò)MTT法從31種植物提取物中初步篩選出夾竹桃、牛耳風(fēng)、牡荊三種具有較強(qiáng)抗鼻咽癌活性后,進(jìn)一步縮小藥物檢測(cè)濃度范圍,再次通過(guò)MTT法檢測(cè)夾竹桃、牛耳風(fēng)、牡荊三種的抗鼻咽癌活性,以進(jìn)一步比較其抗鼻咽癌活性大小。結(jié)果顯示：牛耳風(fēng)提取物可抑制鼻咽癌CNE2(P=0.0357)和肺癌A549(P=0.0026)細(xì)胞生長(zhǎng),且具有劑量依賴性。經(jīng)計(jì)算,牛耳風(fēng)提取物對(duì)CNE2和A549細(xì)胞的IC50分別為22.70931μg/ml和78.38118μg/ml牡荊提取物可抑制鼻咽癌CNE2(P0.0001)和肺癌A549(P0.0001)細(xì)胞生長(zhǎng),且具有劑量依賴性。經(jīng)計(jì)算,牡荊提取物對(duì)CNE2和A549細(xì)胞的IC50分別為130.6466μg/ml和184.6874μg/ml。夾竹桃提取物可顯著抑制鼻咽癌CNE2(P0.01)和肺癌A549(P0.01)細(xì)胞生長(zhǎng),且具有劑量依賴性。經(jīng)計(jì)算,夾竹桃提取物對(duì)CNE2和A549細(xì)胞的IC50分別為3.082226μg/ml和5.04μg/ml。通過(guò)分析比較這三種植物提取物抗鼻咽癌的IC50值大小后發(fā)現(xiàn)夾竹桃IC50值最小。 2、流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)法比較：采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)夾竹桃、牛耳風(fēng)、牡荊三種植物提取物對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞凋亡的影響(PI和Annexin-V雙標(biāo)法)。通過(guò)分析比較從這三種植物提取物中篩選出一種最佳的抗鼻咽癌藥物,并對(duì)其抗鼻咽癌作用及機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。通過(guò)分析比較這三種植物提取物誘導(dǎo)鼻咽癌凋亡率大小后發(fā)現(xiàn)夾竹桃誘導(dǎo)鼻咽癌效果最顯著。經(jīng)MTT篩選及凋亡檢測(cè)雙重篩查后篩選出的最佳抗鼻咽癌藥物是：夾竹桃提取物。 (A)、牛耳風(fēng)提取物顯著誘導(dǎo)鼻咽癌CNE2細(xì)胞(F=30.85,P=0.0007)凋亡。 取濃度分別為0μg/ml、12.5μg/ml、25μg/nd的牛耳風(fēng)提取物作用于CNE2細(xì)胞24小時(shí)后,凋亡比例分別為：3.37±1.650,22.47±5.479、36.73±7.001,凋亡細(xì)胞比例隨藥物濃度的增加而顯著增加。經(jīng)單因素方差分析,各組凋亡率之間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (B)、牡荊提取物可誘導(dǎo)鼻咽癌CNE2細(xì)胞(F=27.95,P=0.0009)凋亡。 取濃度分別為Opg/ml、75μg/ml、150μg/ml的牡荊提取物作用于CNE2細(xì)胞48小時(shí)后,凋亡比例分別為：3.37±1.650,12.37±±2.815、27.17±5.988,凋亡細(xì)胞比例隨藥物濃度的增加而顯著增加。經(jīng)單因素方差分析,各組凋亡率之間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (C)、夾竹桃提取物顯著誘導(dǎo)鼻咽癌CNE2細(xì)胞(F=37.06,P=0.0004)凋亡。取濃度分別為0μg/ml、1.5μg/ml、3μg/ml的夾竹桃提取物作用于CNE2細(xì)胞18小時(shí)后,凋亡比例分別為：3.37±1.650,27.07±4.924、37.43±6.862,凋亡細(xì)胞比例隨藥物濃度的增加而顯著增加。經(jīng)單因素方差分析,各組凋亡率之間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 三、夾竹桃提取物能顯著抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞(F=153.6,P0.0001)克隆形成。采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)夾竹桃提取物抑制鼻咽癌細(xì)胞克隆形成的情況,分別取0μg/ml、1.5μg/ml、3μg/ml夾竹桃提取物作用于鼻咽癌CNE2細(xì)胞2周后,克隆形成數(shù)量分別為：255.33±28.746、30.67±15.822、10.33±2.517。細(xì)胞克隆形成數(shù)量隨著藥物濃度的增加而減少,呈劑量依賴關(guān)系。經(jīng)單因素方差分析,各濃度組別之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 四、夾竹桃提取物抑制鼻咽癌干細(xì)胞生長(zhǎng)。 1、夾竹桃提取物降低鼻咽癌CNE2側(cè)群細(xì)胞比例(F=27.40,P=0.001)。取濃度分別為0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml的夾竹桃提取物作用于CNE2細(xì)胞48小時(shí)后,側(cè)群細(xì)胞比例分別為：3.27±0.764、1.23±0.493、0.13±0.058。經(jīng)單因素方差分析,各濃度組別之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、夾竹桃提取物能抑制鼻咽癌CNE2腫瘤球直徑大小(F=9.105,P=0.0023)。腫瘤球含有腫瘤干細(xì)胞的多種特性,通過(guò)腫瘤球培養(yǎng)法觀察夾竹桃提取物對(duì)腫瘤干細(xì)胞的影響。細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清腫瘤球培養(yǎng)基中,取濃度分別為0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml的夾竹桃提取物處理CNE2細(xì)胞1-2周后檢測(cè)腫瘤球直徑,直徑分別為：501.00±160.558μm、300.33±146.374μm、170.33±81.206μm、96.33±32.532μm、44.00±19.519μm。經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�？梢哉J(rèn)為夾竹桃提取物能抑制鼻咽癌腫瘤球直徑大小,藥物濃度越大,腫瘤球直徑越小。 3、夾竹桃提取物抑制原代鼻咽癌CNE2腫瘤球成球數(shù)量(F=36.57,P0.0001)。取濃度分別為0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/mh、3μg/ml的夾竹桃提取物處理CNE2細(xì)胞1-2周后,腫瘤球形成數(shù)量(個(gè))分別為：546.33±114.269、345.67±68.017、151.33±39.829、66.67±17.039、17.67±7.638。經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、夾竹桃提取物抑制第二代鼻咽癌CNE2腫瘤球成球數(shù)量(F=13.88,P=0.0007)。第2代腫瘤球培養(yǎng)中,將經(jīng)夾竹桃提取物處理后的原代腫瘤球再次消化,為單細(xì)胞懸液,重新進(jìn)行腫瘤球培養(yǎng),共7天,不加入任何藥物處理。各組細(xì)胞再次形成腫瘤球的能力不同,各組第二代腫瘤球形成數(shù)量(個(gè))分別為：273.00±98.686、172.33±39.004、95.67±28.537、33.67±6.658、16.33±4.163。經(jīng)完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)的單因素方差分析,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 五、夾竹桃提取物抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制取濃度為3μg/ml的夾竹桃提取物處理鼻咽癌CNE2細(xì)胞3天后westernblot檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路及線粒體途徑凋亡信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,夾竹桃提取物處理組的PI3K和Akt磷酸化水平表達(dá)量降低,而總的PI3K和Akt蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化,這表明夾竹桃提取物抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用可能是通過(guò)P13K/Akt信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。另外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,與空白對(duì)照組相比,夾竹桃提取物處理組的促凋亡因子Bad的表達(dá)水平明顯上調(diào),抑凋亡因子Bcl-2表達(dá)水平顯著下調(diào),而抑凋亡因子Bcl-XL的表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化,同時(shí),具有活性的cleaved caspase-3表達(dá)水平明顯上調(diào),這表明,在夾竹桃提取物誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的事件中,線粒體途徑參與其中。綜上所述,夾竹桃提取物抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制可能是通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路[21-35]來(lái)實(shí)現(xiàn)的,通過(guò)抑制PI3K和Akt磷酸化,進(jìn)而上調(diào)促凋亡因子Bad的表達(dá),下調(diào)抑凋亡因子Bcl-2的表達(dá),并通過(guò)線粒體凋亡途徑(內(nèi)源性凋亡途徑)[36-46]活化caspase-3,從而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 六、夾竹桃提取物抑制鼻咽癌干細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制β-catenin、c-myc、nanog及oct4是維持腫瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)和維持干細(xì)胞特性的重要因子,也是重要的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。本研究取濃度為3μg/ml的夾竹桃提取物處理鼻咽癌CNE2細(xì)胞3天后western blot檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,夾竹桃提取物處理組的β-catenin磷酸化水平表達(dá)量降低,而總的β-catenin蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化,同時(shí),c-myc表達(dá)也水平明顯降低,而nanog及oct4表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化,這表明夾竹桃提取物抑制鼻咽癌干細(xì)胞生長(zhǎng)的作用可能是通過(guò)抑制β-catenin磷酸化以及抑制c-myc表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 結(jié)論：①夾竹桃、牛耳風(fēng)、牡荊三種植物提取物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有較強(qiáng)抑制效應(yīng),其中夾竹桃的抑制效應(yīng)最強(qiáng)。②夾竹桃提取物能抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng),其分子機(jī)制可能是通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。③夾竹桃提取物可通過(guò)抑制PI3K和Akt磷酸化,進(jìn)而上調(diào)促凋亡因子Bad的表達(dá),下調(diào)抑凋亡因子Bcl-2的表達(dá),并通過(guò)線粒體凋亡途徑(內(nèi)源性凋亡途徑)活化caspase-3,從而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。④夾竹桃提取物能抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的自我更新,其分子機(jī)制可能是通過(guò)抑制β-catenin磷酸化以及抑制c-myc表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 腫瘤干細(xì)胞 夾竹桃
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-14
• 前言14-23
• 第一章 夾竹桃等31種廣東植物對(duì)鼻咽癌生長(zhǎng)的影響23-52
• 材料與方法23-30
• 結(jié)果30-45
• 討論45-51
• 結(jié)論51-52
• 第二章 夾竹桃提取物對(duì)鼻咽癌生長(zhǎng)的影響及其作用的分子機(jī)制52-88
• 材料與方法52-69
• 結(jié)果69-81
• 討論81-87
• 結(jié)論87-88
• 全文小結(jié)88-90
• References90-106
• 中英文縮略詞表106-107
• 致謝107-108

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 陳培;張欽憲;;PTEN-PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤[J];癌變·畸變·突變;2010年06期

2 章雄文,黃自強(qiáng),李常春;黃花夾竹桃甙抗瘤作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究[J];癌癥;1996年06期

3 曾凡星;朱晗;趙華;;PI3K阻斷劑對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)骨骼肌Akt/mTOR信號(hào)的影響[J];北京體育大學(xué)學(xué)報(bào);2010年11期

4 鄧如明;孫春明;馮鳴;王君祥;周幽心;;PI3K、AKT、PTEN在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義[J];中國(guó)神經(jīng)腫瘤雜志;2010年02期

5 張國(guó)千;;鼻咽癌放射治療后放射性腦損傷的診斷及防治[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2009年18期

6 鄧益平;毛凱;雷松柏;;鼻咽癌的CT診斷(附47例分析)[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2011年09期

7 張浩;房殿春;羅元輝;蘭春慧;;線粒體途徑在幽門螺桿菌誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡中的作用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年05期

8 吳建璋;肖義軍;陳炳華;曾紅;;夾竹桃多糖抗小鼠S_(180)肉瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J];福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年04期

9 瞿舒裴;左秋芳;李靜;;積雪草苷霜治療鼻咽癌放射性皮炎的效果觀察[J];護(hù)士進(jìn)修雜志;2010年04期

10 阮培剛;;護(hù)理干預(yù)在減輕鼻咽癌患者放療中口腔黏膜炎的作用[J];護(hù)士進(jìn)修雜志;2012年04期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 龔道軍;CD97-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞株MKN45生物學(xué)特性的影響及其分子機(jī)制的初步研究[D];浙江大學(xué);2009年

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本文編號(hào)：939429