本文關(guān)鍵詞：白內(nèi)障致病基因HSF4與SNF8相互作用的鑒定

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【摘要】：先天性白內(nèi)障是兒童致盲的主要原因之一，發(fā)病率大約為0.3-1.5/1000，近一半的先天性白內(nèi)障是與遺傳相關(guān)的，已經(jīng)確定的可導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的有26個(gè)致病基因，以及大約40個(gè)可能的基因位點(diǎn)。在調(diào)控晶狀體早起發(fā)育中，熱休克轉(zhuǎn)錄因子4（HSF4）作為轉(zhuǎn)錄因子起到關(guān)鍵作用，位于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致先天性白內(nèi)障。HSF4有HSF4a和HSF4b兩種亞型。HSF4b缺失可下調(diào)鼠晶狀體中熱休克蛋白的表達(dá)，同時(shí)還會(huì)上調(diào)FGF家族成員的表達(dá)。然而，HSF4轉(zhuǎn)錄活性的具體分子機(jī)制尚不清楚，研究與HSF4相互作用的蛋白質(zhì)對(duì)于建立HSF4相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，以及這一轉(zhuǎn)錄因子是如何在晶狀體發(fā)育中發(fā)揮作用的具有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，通過(guò)酵母雙雜交的方法發(fā)現(xiàn)可能與HSF4存在相互作用的蛋白質(zhì)——SNF8。本文主要利用GST pull-down技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)這兩種方法對(duì)酵母雙雜交結(jié)果——HSF4與SNF8之間存在相互作用進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。 本實(shí)驗(yàn)中首先通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)SNF8在小鼠晶狀體中表達(dá)，蛋白印跡分析發(fā)現(xiàn)其在人的晶狀體上皮（HLE）細(xì)胞中表達(dá)。從HLE細(xì)胞cDNA文庫(kù)中克隆得到SNF8基因全長(zhǎng)，并將其編碼序列插入真核表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-7.1中，測(cè)序后轉(zhuǎn)染HLE細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)；同時(shí)將重組的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-hsf4b轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)過(guò)谷胱甘肽TM4B瓊脂糖珠純化后與含有上述外源表達(dá)SNF8蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解液進(jìn)行孵育，最后通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)HSF4b與SNF8之間存在相互作用。 基于GST pull-down的結(jié)果，我們用免疫共沉淀的方法對(duì)HSF4b與SNF8之間的互作關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證分析。將真核表達(dá)質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-7.1-SNF8和pEGFP-Hsf4b-wt共同轉(zhuǎn)入HLE細(xì)胞，48小時(shí)后裂解細(xì)胞，向裂解液中加入抗標(biāo)簽蛋白的抗體進(jìn)行孵育，再與Protein A/G瓊脂糖珠子孵育一段時(shí)間，洗滌洗脫后經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，表明HSF4b與SNF8之間確實(shí)存在相互作用。為揭示HSF4關(guān)鍵的功能元件，我們進(jìn)一步通過(guò)系列缺失的方法，，驗(yàn)證蛋白質(zhì)HSF4b內(nèi)部不同的結(jié)構(gòu)域在這一相互作用過(guò)程中的意義，發(fā)現(xiàn)HSF4b的DBD結(jié)構(gòu)域和HR A/B結(jié)構(gòu)域?qū)τ贖SF4b與SNF8之間的相互作用是至關(guān)重要的，而DHR結(jié)構(gòu)域則對(duì)二者相互作用影響不大。
【關(guān)鍵詞】：先天性白內(nèi)障 HSF4 SNF8 免疫組化 免疫共沉淀
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R776.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 1 前言9-18
• 1.1 先天性白內(nèi)障研究進(jìn)展9-12
• 1.2 HSF4 基因與先天性白內(nèi)障12-14
• 1.3 SNF8 基因概述14-15
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法概述15-18
• 2 材料與方法18-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟25-37
• 3 結(jié)果與討論37-44
• 3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-41
• 3.2 討論41-44
• 4 總結(jié)和展望44-46
• 致謝46-48
• 參考文獻(xiàn)48-53

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳謀通;劉建軍;;蛋白質(zhì)相互作用的研究方法[J];生物技術(shù)通報(bào);2009年01期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張軍;熱休克轉(zhuǎn)錄因子4基因突變致先天性白內(nèi)障分子機(jī)理研究[D];河南大學(xué);2010年

本文編號(hào)：929083