本文關(guān)鍵詞：PCR-RFLP法快速鑒定鐮刀菌感染的真菌性角膜炎

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【摘要】：目的：從臨床疑似真菌感染性角膜炎患者的角膜刮片中分離、提取DNA,建立一種臨床常見真菌的基因聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測方法，進行實驗研究以及臨床應(yīng)用。 方法：根據(jù)醫(yī)學(xué)真菌的線粒體細胞色素C氧化酶亞基I（COI）基因片段合成了鐮刀菌、青霉菌、擬青霉菌、白僵菌、紅酵母等5種臨床常見真菌的通用引物。取臨床標本，，分離真菌菌株，采用應(yīng)用改良的GenTLETMDNA試劑盒提取方法方法提取DNA，用以上引物以及真菌通用引物ITS以及COI擴增基因組的ITS和COI的基因片段并測序，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進行同源序列搜索及分析，用限制性內(nèi)切酶SspI及VspI酶切目的片段，行2.0%TAE瓊脂糖凝膠電泳照相觀察，分析比較酶切圖譜，初步檢測其特異性。 結(jié)果：各菌株基因組DNA經(jīng)ITS1、ITS4擴增后得到的片段長度約為550bp，產(chǎn)物分別回收進行核苷酸序列測定，并與GenBank中相應(yīng)序列進行比對，以鑒定菌種。各菌株基因組DNA經(jīng)COI-all1，COI－all2引物擴增后得到的目的片段長度在450bp左右。測序后進行酶切分析，用限制性內(nèi)切酶SspI及VspI酶切目的片段，根據(jù)酶切圖譜可以進一步將鐮刀菌鑒定到種。 結(jié)論：本研究中6種菌15株均可以用COI-all1，COI－all2引物擴增，得到450bp左右的片段。使用COI擴增的茄病鐮刀菌，尖孢鐮刀菌，串珠鐮刀菌的PCR產(chǎn)物經(jīng)VspI和SspI兩種限制性內(nèi)切酶酶切條帶具有種內(nèi)多態(tài)性，提示可以用于鑒別鐮刀菌屬的種間鑒定。限制性片段長度多態(tài)性分析方法可用于快速、簡便地將鐮刀菌鑒定到種，有很好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：鐮刀菌屬 角膜炎 聚合酶鏈反應(yīng) 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R772.21
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 前言10-14
• 第二章 材料與方法14-21
• （一）實驗菌株14
• （二）主要試劑及配制：14-17
• 1. 試劑名稱14-15
• 2. 試劑配制15
• 3. 主要儀器設(shè)備15-16
• 4. 菌種通用引物的選擇16
• 5. 菌種特異性引物設(shè)計16-17
• （三）實驗方法17-21
• 1. 菌株的培養(yǎng)17
• 2. 真菌 DNA 提取17-18
• 3. ITS 引物 PCR 反應(yīng)條件18
• 4. COI 引物的 PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化18-19
• 5. 瓊脂糖凝膠電泳19
• 6. PCR 反應(yīng)產(chǎn)物純化19
• 7. 限制性片段長度多態(tài)性(PCR－RFLP)19-21
• 第三章 結(jié)果21-26
• （一）基因組 DNA 的提取及濃度的檢測21-22
• （二）ITS 引物 PCR 反應(yīng)及測序結(jié)果22
• （三）COI 引物的 PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果22-23
• （四）各菌株 COI 引物擴增結(jié)果23
• （五）RFLP 結(jié)果23-26
• 第四章 討論26-30
• 第五章 結(jié)論30-31
• 參考文獻31-34
• 綜述34-50
• 參考文獻44-50
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果50-51
• 致謝51-52

【參考文獻】

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本文編號：900051