發(fā)布時間：2017-09-16 09:48

  本文關(guān)鍵詞：蒽醌化合物GXHSWAQ-2介導(dǎo)鼻咽癌放射增敏的線粒體差異蛋白分析及CDH1蛋白功能研究

  更多相關(guān)文章： 鼻咽癌細胞 蒽醌化合物GXHSWAQ-2 放射增敏 線粒體蛋白 RNA干擾 CDH1

【摘要】：目的：通過生物信息學(xué)方法分析葸醌化合物GXHSWAQ-2促進鼻咽癌細胞放射增敏的線粒體差異表達蛋白質(zhì)的質(zhì)譜結(jié)果,篩選出與放射增敏密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白靶點。并選取CDH1蛋白質(zhì)作為研究對象,構(gòu)建RNA干擾CDH1慢病毒表達體系,探討沉默該蛋白質(zhì)對鼻咽癌細胞生物學(xué)行為的影響,為尋找GXHSWAQ-2放射增敏的蛋白靶點提供依據(jù)。 方法：(1)根據(jù)差異蛋白篩選原則統(tǒng)計分析與放射增敏相關(guān)線粒體差異蛋白,并通過DAVID數(shù)據(jù)庫對差異蛋白質(zhì)的亞細胞定位、分子功能和參與的生物過程進行聚類分析。利用STRING數(shù)據(jù)庫繪制差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)合NCBI、uniprot、KEGG等數(shù)據(jù)庫分析篩選候選的關(guān)鍵蛋白質(zhì)；(2)應(yīng)用Western blot驗證候選靶蛋白的表達水平；(3)利用基因重組技術(shù),構(gòu)建針對CDH1靶蛋白的四條shRNA干擾慢病毒表達載體,轉(zhuǎn)鼻咽癌CNE-1細胞,經(jīng)由熒光定量PCR和in-cell Western方法篩選出沉默效果最佳的干擾片段。通過流式細胞儀分選、建立穩(wěn)定沉默CDH1表達的細胞亞系；(4)對沉默CDH1表達后鼻咽癌CNE-1細胞,分別采用MTT法繪制細胞的生長曲線；劃痕法檢測細胞遷移能力；流式細胞儀分析細胞生長周期。 結(jié)果：(1)照射組、GXHSWAQ-2組和GXHSWAQ-2聯(lián)合照射組3組與空白對照組比較差異蛋白共有195種,其中上調(diào)68種,下調(diào)127種。這部分蛋白質(zhì)主要定位于細胞器、核內(nèi)和細胞骨架上,參與細胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運及代謝、RNA轉(zhuǎn)錄翻譯和加工、細胞應(yīng)激反應(yīng)、細胞周期調(diào)節(jié)和氧化還原反應(yīng)等生物過程。通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖分析確定RAC1CDH1HSP90、 CDC42、 COPS2等5個與放射增敏相關(guān)的候選靶蛋白；(2) Western blot方法證實RAC1與CDH1在各組細胞中的表達與質(zhì)譜結(jié)果基本一致；(3)成功構(gòu)建了慢病毒干擾CDH1表達載體,測序結(jié)果顯示插入序列正確。轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-1細胞后,熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明慢病毒感染有效。in-cell Western和熒光定量PCR結(jié)果顯示LV-CDH1-homo-1184片段的沉默CDH1效果最好(尸0.05)。經(jīng)流式細胞儀分選感染LV-CDH1-homo-1184片段的細胞后,長期培養(yǎng),熒光不消失,CDH1表達仍較空白組和陰性對照組低,獲得穩(wěn)定沉默CDHl表達的鼻咽癌CNE-1細胞株；(4)MTT法繪制出空白對照組、陰性對照組和LV-CDH1-homo-1184組細胞生長曲線,發(fā)現(xiàn)各組細胞增殖趨勢一致。其中陰性對照組細胞生長速度最快,LV-CDH1-homo-1184組細胞生長速度最慢。劃痕結(jié)果表明各組細胞的劃痕隨時間延長,逐漸愈合,其中LV-CDH1-homo-1184細胞遷移速率相對較慢；細胞周期分析結(jié)果表明,LV-CDH1-homo-1184組細胞處于G2M期比例相對較高。 結(jié)論：(1)通過生物信息學(xué)分析,RAC1、CDH1、CDC42、HSP90、 COPS2五個蛋白有可能成為葸醌化合物GXHSWAQ-2放射增敏作用的蛋白靶點。(2)沉默了CDH1的鼻咽癌細胞其生物學(xué)行為發(fā)生了一定的改變,CDH1有可能成為鼻咽癌放射治療新的靶點。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌細胞 蒽醌化合物GXHSWAQ-2 放射增敏 線粒體蛋白 RNA干擾 CDH1
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10-14
• 參考文獻12-14
• 第一章 GXHSWAQ-2促進鼻咽癌細胞放射增敏的線粒體差異表達蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析14-52
• 1 材料14-15
• 2 方法15-19
• 2.1 蛋白質(zhì)表達的差異分析15-16
• 2.2 與增敏相關(guān)的差異蛋白表達模式分析16
• 2.3 差異蛋白并集分析16-17
• 2.4 差異蛋白質(zhì)譜結(jié)果western blot驗證17-19
• 3 結(jié)果19-43
• 3.1 蛋白表達的差異統(tǒng)計19-37
• 3.2 與增敏相關(guān)的差異蛋白表達模式統(tǒng)計37-38
• 3.3 差異蛋白的GO聚類分析38-39
• 3.4 節(jié)點蛋白分析結(jié)果39-43
• 3.5 蛋白免疫印跡驗證差異蛋白相對表達量43
• 4 討論43-49
• 參考文獻49-52
• 第二章 RNA干擾CDH1慢病毒載體構(gòu)建及干擾后鼻咽癌細胞生物學(xué)行為研究52-83
• 1 材料52-55
• 2 實驗方法55-66
• 2.1 RNA干擾靶點設(shè)計及shRNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建55-59
• 2.2 有效干擾靶序列的篩選59-65
• 2.3 干擾后鼻咽癌細胞生物學(xué)行為研究65-66
• 3 結(jié)果66-78
• 3.1 慢病毒載體測序結(jié)果66-67
• 3.2 熒光顯微鏡下觀察各轉(zhuǎn)染組熒光表達情況67-69
• 3.3 熒光定量PCR方法確定干擾片段沉默效果69-71
• 3.4 in-cell Western方法確定干擾片段沉默效果71-73
• 3.5 獲得穩(wěn)定沉默CDH1表達的鼻咽癌CNE-1細胞株73
• 3.6 干擾CDH1后鼻咽癌CNE-1細胞的生長曲線73-75
• 3.7 干擾后細胞遷移能力的變化75-76
• 3.8 流式細胞儀檢測不同干預(yù)處理后細胞周期的變化76-78
• 4 討論78-81
• 參考文獻81-83
• 全文小結(jié)83-84
• 綜述84-93
• 1. RNA干擾概述84
• 2. RNAi在藥物研發(fā)中的應(yīng)用84-88
• 3. 展望88-89
• 參考文獻89-93
• 致謝93-94
• 攻讀碩士研究生學(xué)位期間參與的課題及發(fā)表的論文94

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 翁婉雯;許玉杰;萬建美;王宗站;丁文秀;劉敏;洪承皎;;紫杉醇放射增敏作用的分子機制[J];癌癥;2009年08期

2 陳琳;徐酉華;溫賢浩;楊山;于潔;戴碧濤;李欣;;RNA干擾survivin基因?qū)562細胞化療敏感性的影響及機制[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2008年22期

3 鐘琦;黃志剛;王琪;房居高;陳曉紅;張偉;王鴻;洪銳;楊征;;MDR1基因RNA干擾逆轉(zhuǎn)喉癌細胞多藥耐藥性的研究[J];中國耳鼻咽喉頭頸外科;2010年05期

4 任維維;李征;米登海;楊克虎;田金徽;張質(zhì)鋼;;甘氨雙唑鈉對非小細胞肺癌放射治療增敏作用的Meta分析[J];中國肺癌雜志;2012年06期

5 周庚寅;張曉芳;;腫瘤多藥耐藥機制及其逆轉(zhuǎn)[J];臨床與實驗病理學(xué)雜志;2009年04期

6 劉瑾;吳錦昌;周俊東;;POLⅠ基因?qū)θ耸彻馨┘毎呕熋舾行缘挠绊慬J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2013年01期

7 趙維勇;孫新臣;;放射治療增敏的研究現(xiàn)狀[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2012年07期

8 唐軍;傅大煦;;靶向小分子創(chuàng)新藥物[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2010年20期

9 郭會燦;;RNA干擾技術(shù)的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用[J];生物技術(shù)通報;2011年04期

10 仇波;林毅;王勇;陶鈞;歐紹武;王運杰;;紫杉醇在TRAIL誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤干細胞凋亡中的增敏作用研究[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2013年03期

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本文編號：862333