本文關(guān)鍵詞：蒽醌化合物GXHSWAQ-2介導(dǎo)鼻咽癌放射增敏的線粒體差異蛋白分析及CDH1蛋白功能研究

  更多相關(guān)文章： 鼻咽癌細(xì)胞 蒽醌化合物GXHSWAQ-2 放射增敏 線粒體蛋白 RNA干擾 CDH1

【摘要】：目的：通過(guò)生物信息學(xué)方法分析葸醌化合物GXHSWAQ-2促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞放射增敏的線粒體差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜結(jié)果,篩選出與放射增敏密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)。并選取CDH1蛋白質(zhì)作為研究對(duì)象,構(gòu)建RNA干擾CDH1慢病毒表達(dá)體系,探討沉默該蛋白質(zhì)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,為尋找GXHSWAQ-2放射增敏的蛋白靶點(diǎn)提供依據(jù)。 方法：(1)根據(jù)差異蛋白篩選原則統(tǒng)計(jì)分析與放射增敏相關(guān)線粒體差異蛋白,并通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位、分子功能和參與的生物過(guò)程進(jìn)行聚類分析。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)繪制差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)合NCBI、uniprot、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)分析篩選候選的關(guān)鍵蛋白質(zhì)；(2)應(yīng)用Western blot驗(yàn)證候選靶蛋白的表達(dá)水平；(3)利用基因重組技術(shù),構(gòu)建針對(duì)CDH1靶蛋白的四條shRNA干擾慢病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞,經(jīng)由熒光定量PCR和in-cell Western方法篩選出沉默效果最佳的干擾片段。通過(guò)流式細(xì)胞儀分選、建立穩(wěn)定沉默CDH1表達(dá)的細(xì)胞亞系；(4)對(duì)沉默CDH1表達(dá)后鼻咽癌CNE-1細(xì)胞,分別采用MTT法繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞生長(zhǎng)周期。 結(jié)果：(1)照射組、GXHSWAQ-2組和GXHSWAQ-2聯(lián)合照射組3組與空白對(duì)照組比較差異蛋白共有195種,其中上調(diào)68種,下調(diào)127種。這部分蛋白質(zhì)主要定位于細(xì)胞器、核內(nèi)和細(xì)胞骨架上,參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、RNA轉(zhuǎn)錄翻譯和加工、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和氧化還原反應(yīng)等生物過(guò)程。通過(guò)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖分析確定RAC1CDH1HSP90、 CDC42、 COPS2等5個(gè)與放射增敏相關(guān)的候選靶蛋白；(2) Western blot方法證實(shí)RAC1與CDH1在各組細(xì)胞中的表達(dá)與質(zhì)譜結(jié)果基本一致；(3)成功構(gòu)建了慢病毒干擾CDH1表達(dá)載體,測(cè)序結(jié)果顯示插入序列正確。轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-1細(xì)胞后,熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明慢病毒感染有效。in-cell Western和熒光定量PCR結(jié)果顯示LV-CDH1-homo-1184片段的沉默CDH1效果最好(尸0.05)。經(jīng)流式細(xì)胞儀分選感染LV-CDH1-homo-1184片段的細(xì)胞后,長(zhǎng)期培養(yǎng),熒光不消失,CDH1表達(dá)仍較空白組和陰性對(duì)照組低,獲得穩(wěn)定沉默CDHl表達(dá)的鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株；(4)MTT法繪制出空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和LV-CDH1-homo-1184組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞增殖趨勢(shì)一致。其中陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快,LV-CDH1-homo-1184組細(xì)胞生長(zhǎng)速度最慢。劃痕結(jié)果表明各組細(xì)胞的劃痕隨時(shí)間延長(zhǎng),逐漸愈合,其中LV-CDH1-homo-1184細(xì)胞遷移速率相對(duì)較慢；細(xì)胞周期分析結(jié)果表明,LV-CDH1-homo-1184組細(xì)胞處于G2M期比例相對(duì)較高。 結(jié)論：(1)通過(guò)生物信息學(xué)分析,RAC1、CDH1、CDC42、HSP90、 COPS2五個(gè)蛋白有可能成為葸醌化合物GXHSWAQ-2放射增敏作用的蛋白靶點(diǎn)。(2)沉默了CDH1的鼻咽癌細(xì)胞其生物學(xué)行為發(fā)生了一定的改變,CDH1有可能成為鼻咽癌放射治療新的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌細(xì)胞 蒽醌化合物GXHSWAQ-2 放射增敏 線粒體蛋白 RNA干擾 CDH1
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10-14
• 參考文獻(xiàn)12-14
• 第一章 GXHSWAQ-2促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞放射增敏的線粒體差異表達(dá)蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析14-52
• 1 材料14-15
• 2 方法15-19
• 2.1 蛋白質(zhì)表達(dá)的差異分析15-16
• 2.2 與增敏相關(guān)的差異蛋白表達(dá)模式分析16
• 2.3 差異蛋白并集分析16-17
• 2.4 差異蛋白質(zhì)譜結(jié)果western blot驗(yàn)證17-19
• 3 結(jié)果19-43
• 3.1 蛋白表達(dá)的差異統(tǒng)計(jì)19-37
• 3.2 與增敏相關(guān)的差異蛋白表達(dá)模式統(tǒng)計(jì)37-38
• 3.3 差異蛋白的GO聚類分析38-39
• 3.4 節(jié)點(diǎn)蛋白分析結(jié)果39-43
• 3.5 蛋白免疫印跡驗(yàn)證差異蛋白相對(duì)表達(dá)量43
• 4 討論43-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 第二章 RNA干擾CDH1慢病毒載體構(gòu)建及干擾后鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為研究52-83
• 1 材料52-55
• 2 實(shí)驗(yàn)方法55-66
• 2.1 RNA干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及shRNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建55-59
• 2.2 有效干擾靶序列的篩選59-65
• 2.3 干擾后鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為研究65-66
• 3 結(jié)果66-78
• 3.1 慢病毒載體測(cè)序結(jié)果66-67
• 3.2 熒光顯微鏡下觀察各轉(zhuǎn)染組熒光表達(dá)情況67-69
• 3.3 熒光定量PCR方法確定干擾片段沉默效果69-71
• 3.4 in-cell Western方法確定干擾片段沉默效果71-73
• 3.5 獲得穩(wěn)定沉默CDH1表達(dá)的鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株73
• 3.6 干擾CDH1后鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線73-75
• 3.7 干擾后細(xì)胞遷移能力的變化75-76
• 3.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同干預(yù)處理后細(xì)胞周期的變化76-78
• 4 討論78-81
• 參考文獻(xiàn)81-83
• 全文小結(jié)83-84
• 綜述84-93
• 1. RNA干擾概述84
• 2. RNAi在藥物研發(fā)中的應(yīng)用84-88
• 3. 展望88-89
• 參考文獻(xiàn)89-93
• 致謝93-94
• 攻讀碩士研究生學(xué)位期間參與的課題及發(fā)表的論文94

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：862333