本文關(guān)鍵詞：酵母雙雜交法篩選鼻咽癌細(xì)胞中Flot2相互作用蛋白

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【摘要】：鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)是一種起源于鼻咽部的惡性腫瘤,在我國(guó)南方省份、東南亞國(guó)家和非洲部分地區(qū)高發(fā)。其發(fā)病可能是膳食結(jié)構(gòu)、病毒感染、遺傳突變和環(huán)境因素等多個(gè)因素共同作用導(dǎo)致的。臨床上鼻咽癌具有早期頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。研究表明大部分患者以頸部淋巴結(jié)腫大為最初表現(xiàn),相當(dāng)部分患者會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者治療失敗和復(fù)發(fā)的幾率則大大增加。 浮艦蛋白Flotillins家族最早是在金魚(yú)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞受損后軸突的再生過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)蛋白,是一種脂筏標(biāo)志性蛋白,主要定位于細(xì)胞膜內(nèi)表面,在多種類(lèi)型細(xì)胞中廣泛存在。在細(xì)胞膜上,其作為腳架,為蛋白間相互作用提供平臺(tái),也參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)再生、內(nèi)吞作用、淋巴細(xì)胞活化等。 前期工作中,我們利用抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization, SSH),以來(lái)源于同一鼻咽癌細(xì)胞系SUNE-1的具有不同轉(zhuǎn)移能力的兩個(gè)亞株5-8F(高成瘤、高轉(zhuǎn)移能力)和6-10B(成瘤、無(wú)轉(zhuǎn)移能力)為材料,構(gòu)建了兩個(gè)亞細(xì)胞株間的消減cDNA文庫(kù),發(fā)現(xiàn)了與轉(zhuǎn)移相關(guān)的數(shù)個(gè)差異表達(dá)的基因,然后選擇Flotillin-2(Flot2)作為后續(xù)的研究對(duì)象。采用RNAi技術(shù)干擾Flot2后5-8F細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力均下降,G1期細(xì)胞比例上升,提示Flot2可能與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移正相關(guān)。 本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,通過(guò)構(gòu)建5-8F細(xì)胞系的cDNA文庫(kù),采用酵母雙雜交技術(shù)篩選出Flot2目互作用蛋白并進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 首先,我們以NCBI上的Flot2基因CDS序列為模板從5-8F細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出了其ORF序列,然后我們將其體外連接到pGBKT7-BD載體上,構(gòu)建了該基因的酵母誘餌表達(dá)載體(pGBKT7-Flot2)。同時(shí),利用LD-PCR方法構(gòu)建了5-8F細(xì)胞的cDNA文庫(kù)并同源重組進(jìn)pGADT7-AD載體中,構(gòu)建了pGADT7-cDNA的文庫(kù)質(zhì)粒。將上述載體分別轉(zhuǎn)化Y2HGold和Y187酵母菌,采用酵母雙雜交的方法篩選出陽(yáng)性克隆,然后抽提質(zhì)粒測(cè)序分析,將可能的相互作用蛋白的質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒再次共轉(zhuǎn)化Y2HGold菌鑒定。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示以Flot2為誘餌蛋白篩選5-8F細(xì)胞文庫(kù)后獲得陽(yáng)性克隆36個(gè),經(jīng)過(guò)測(cè)序與序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)有5個(gè)蛋白(PLCD3、 PCD7、PTPRJ、PCBP1和copine Ⅱ)有可能與Flot2有相互作用,然后通過(guò)共轉(zhuǎn)化的方法鑒定了是否發(fā)生相互作用,回交結(jié)果顯示其中4個(gè)蛋白(PLCD3、PCDH7、PTPRJ、PCBP1)確定與Flot2有相互作用。 本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上,建立了5-8F細(xì)胞系的酵母雙雜交文庫(kù)和穩(wěn)定表達(dá)FLOT2的Y2HGold酵母菌株；篩選出了與Flot2蛋白相互作用的4個(gè)候選蛋白并進(jìn)行了初步的鑒定,為進(jìn)一步研究Flot2的功能及其在鼻咽癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用提供了依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 flotillin-2(Flot2) 轉(zhuǎn)移 酵母雙雜交
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 目錄9-10
• ~.寫(xiě)詞簡(jiǎn)表10-11
• 前言11-14
• 技術(shù)路線圖14-16
• 第一部分 材料與方法16-31
• 1.1 材料16-19
• 1.2 方法19-31
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-44
• 2.1 pGBKT7-Flot2誘餌載體的構(gòu)建及自激活和毒性檢測(cè)31-35
• 2.2 5-8F細(xì)胞系酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建35-36
• 2.3 酵母雙雜交篩選Flot2相互作用蛋白36-42
• 2.4 FLOT2候選相互作用蛋白的初步鑒定42-44
• 第三章 討論44-48
• 3.1 構(gòu)建高質(zhì)量的酵母雙雜交文庫(kù)44
• 3.2 構(gòu)建PGBKT7-FLOT2誘餌載體44-45
• 3.3 篩選FLOT2相互作用蛋白并初步鑒定45-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 綜述56-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 攻讀學(xué)位期間已發(fā)表和待發(fā)表論文63-64
• 致謝64-65
• 簡(jiǎn)歷65

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 姚開(kāi)泰;鼻咽癌研究的回顧與展望（紀(jì)念湖南醫(yī)科大學(xué)80周年校慶）[J];湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1995年02期

2 段志強(qiáng);王郁楊;朱艷梅;開(kāi)妍;胡順林;王曉泉;劉秀梵;;雞胚成纖維細(xì)胞酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定[J];揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版);2011年02期

3 張鋒,張錦明;Clinical hereditary characteristics in nasopharyngeal carcinoma through Ye-Liang's family cluster[J];Chinese Medical Journal;1999年02期

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本文編號(hào)：837679