發(fā)布時(shí)間：2017-09-09 06:52

  本文關(guān)鍵詞：鹽霉素抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 鹽霉素 鼻咽癌 凋亡 Wnt/β-catenin信號(hào)通路

【摘要】：研究背景： 鼻咽癌為我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一,源自鼻咽粘膜上皮細(xì)胞的惡變,是頭頸部腫瘤一個(gè)比較明確的亞類。鼻咽癌有著獨(dú)特的流行病學(xué)、臨床特點(diǎn)、組織病理學(xué)以及病因?qū)W,它的發(fā)生、發(fā)展、臨床表現(xiàn)及相應(yīng)的治療與其他頭頸部腫瘤有一定的區(qū)別,好發(fā)于東南亞、我國(guó)的南方及香港地區(qū),在這些地區(qū)每年的發(fā)病率高達(dá)20/100000。越來越多的證據(jù)表明鼻咽癌的與多種因素有關(guān),包括遺傳學(xué)因素、EB病毒感染、吸煙、飲酒、中草藥的使用及環(huán)境因素。依據(jù)世界衛(wèi)生組織的病理學(xué)分類,鼻咽癌被劃分為三類：角化鱗狀上皮,非角化型,未分化型。鼻咽癌病理類型以未分化鱗癌為主,主要通過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移到頸部淋巴結(jié),也可通過血液轉(zhuǎn)移至肝、肺、骨。盡管作為鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療放射治療,在早期鼻咽癌中取得了滿意的效果,能極大地提高總生存期及無病生存期,但是對(duì)于中晚期患者,放化療綜合治療卻并未取得理想的效果,許多病人出現(xiàn)放化療的抵抗,并且毒副作用較重,最終產(chǎn)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。因此,有必要尋找更加有效有針對(duì)性的藥物,同時(shí)探討可能的作用機(jī)制,更好地治療鼻咽癌。 鹽霉素(Salinomycin, Sal),又名沙利霉素,為一種聚醚類抗生素,常被用作飼養(yǎng)家禽以提高營(yíng)養(yǎng)攝取率,近年來研究表明相比傳統(tǒng)的乳腺癌常規(guī)化療藥紫杉醇,鹽霉素能有效降低乳腺癌干細(xì)胞的比例,在體內(nèi),其還能抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、降低微球形成比例及抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究表明,鹽霉素還能通過多種機(jī)制降低某些腫瘤的惡習(xí)程度,誘導(dǎo)這些腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡,在殺傷腫瘤細(xì)胞方面表現(xiàn)出高效性,同時(shí)不影響正常細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而目前有關(guān)鹽霉素對(duì)鼻咽癌影響的報(bào)道甚少。故本研究擬觀察鹽霉素在體內(nèi)外對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討,從而為鹽霉素應(yīng)用于鼻咽癌治療提供可能的思路。 腫瘤的發(fā)生發(fā)展離不開各種信號(hào)通路的激活或異常改變。研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路在機(jī)體細(xì)胞的發(fā)育、再生及組織的穩(wěn)態(tài)等方面有著重要的作用。越來越多的證據(jù)表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活與多種腫瘤的產(chǎn)生密切相關(guān),包括頭頸部腫瘤、乳腺癌、肝癌、腸癌及肺癌等人類腫瘤。P-catenin蛋白是Wnt/β-catenin信號(hào)通路中一個(gè)關(guān)鍵的中介物。異常的Wnt表達(dá)會(huì)導(dǎo)致P-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累,并進(jìn)入細(xì)胞核,與T細(xì)胞因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor, TCF/LEF)結(jié)合,調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),TCF/LEF是一類具有雙向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子,若結(jié)合P-catenin則促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。LRP6(低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白,LDL-receptor-related protein, LRP6)作為Wnt/β-catenin通路中的另外一個(gè)受體,屬于單次卷曲的跨膜受體,對(duì)于Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要作用,其磷酸化能導(dǎo)致β-catenin復(fù)合物的破壞、P-catenin蛋白的胞內(nèi)聚集以及核轉(zhuǎn)位,最終導(dǎo)致Wnt靶向基因的表達(dá),從而引起細(xì)胞的凋亡、粘附及周期等方面的改變。盡管Wnt信號(hào)通路參與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明,但是越來越多的證據(jù)表明P-catenin蛋白異常表達(dá)與鼻咽癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。 研究目的： 本實(shí)驗(yàn)以人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1(高分化細(xì)胞)、CNE-2(低分化細(xì)胞)、CNE-2/DDP(低分化耐藥細(xì)胞)作為研究對(duì)象,分析鹽霉素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞活力和侵襲能力的影響；在體外,從定性和定量?jī)煞矫嬗^察和分析鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞后是否有凋亡現(xiàn)象的產(chǎn)生及程度分析,從而進(jìn)一步分析鹽霉素介導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞的凋亡途徑及凋亡機(jī)制;在體內(nèi),建立鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的移植瘤模型,觀察用藥后移植瘤的生長(zhǎng)情況及蛋白表達(dá)情況,分析Wnt信號(hào)通路的變化。從而為鹽霉素的進(jìn)一步研究與臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并奠定理論基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.CCK-8實(shí)驗(yàn)研究鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞24h、48h和72h后,三株鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP的體外增殖情況,計(jì)算存活率,并選取合適的低、高兩個(gè)藥物濃度作為后續(xù)研究。 2.侵襲實(shí)驗(yàn)研究不同濃度鹽霉素(對(duì)照組,低濃度組,高濃度組)作用鼻咽癌細(xì)胞48h后的細(xì)胞侵襲能力的改變。 3. Hoechst33258熒光染色法觀察不同濃度鹽霉素(對(duì)照組,低濃度組,高濃度組)作用鼻咽癌細(xì)胞48h后細(xì)胞核形態(tài)的變化,從形態(tài)學(xué)和定性上觀察凋亡現(xiàn)象。 4.采用流式細(xì)胞術(shù),利用annexin-V/PI試劑盒中的熒光探針來檢測(cè)不同濃度藥物(對(duì)照組,低濃度組,高濃度組)作用鼻咽癌細(xì)胞48h后細(xì)胞凋亡的情況。 5.熒光分光光度計(jì)分析不同濃度鹽霉素(對(duì)照組,低濃度組,高濃度組)作用鼻咽癌細(xì)胞48h后細(xì)胞caspases酶活性的改變。 6.采用流式細(xì)胞術(shù),運(yùn)用JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度鹽霉素(對(duì)照組,低濃度組,高濃度組)作用鼻咽癌細(xì)胞48h后細(xì)胞的線粒體活性,從而更進(jìn)一步了解鹽霉素介導(dǎo)的鼻咽癌的凋亡途徑。 7. Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度鹽霉素(對(duì)照組,低濃度組,高濃度組)作用鼻咽癌細(xì)胞48h后細(xì)胞凋亡蛋白家族Bcl-2、Bax及Wnt家族蛋白LRP6、β-catenin蛋白表達(dá)變化。 8.建立鹽霉素治療鼻咽癌CNE-2細(xì)胞移植瘤模型,觀察和比較對(duì)照組和藥物組作用裸鼠后移植瘤的生長(zhǎng)情況,同時(shí)隔天測(cè)量裸鼠體重和皮下移植瘤的體積,繪制生長(zhǎng)曲線；此外,將剝離下來的瘤組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn),檢測(cè)和比較兩組的β-catenin蛋白表達(dá)情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.CCK-8法體外增殖實(shí)驗(yàn)顯示濃度分別0,1,2,4,8and16μM鹽霉素作用于人鼻咽癌CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP細(xì)胞24h、48h和72h后,可見細(xì)胞的生長(zhǎng)都受到抑制,細(xì)胞活力下降。對(duì)于每種細(xì)胞,不同濃度及不同作用時(shí)間引起的細(xì)胞活力改變具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。當(dāng)8μM的鹽霉素作用鼻咽癌CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP細(xì)胞48h后,相比對(duì)照組,細(xì)胞的存活率分別為53%,48%,42.3%。當(dāng)16μ,M的鹽霉素作用鼻咽癌CNE-1細(xì)胞72h后,細(xì)胞抑制率達(dá)到70%以上。 2.侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,鹽霉素作用于鼻咽癌CNE-1、CNE-2、 CNE-2/DDP細(xì)胞48h后的侵襲能力下降,且呈濃度依賴性；相比對(duì)照組及低濃度藥物組(8μM),高濃度藥物組(16μM)作用鼻咽癌細(xì)胞時(shí),穿越至纖維膜下層的細(xì)胞明顯減少。 3.Hoechst33258熒光染色法顯示,鹽霉素作用于人鼻咽癌CNE-1、CNE-2、 CNE-2/DDP細(xì)胞48h后,鏡下觀察到對(duì)照組細(xì)胞染色質(zhì)均勻,淡藍(lán)色的細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則。藥物組則可見明顯核固縮、碎裂,染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成等凋亡特征,且高濃度組更加明顯。 4. Flow cytometry (FCM)檢測(cè)凋亡率顯示,與對(duì)照組相比,鹽霉素作用于人鼻咽癌CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP細(xì)胞48h后,凋亡細(xì)胞增加,凋亡率增加,且呈濃度依賴性。當(dāng)高濃度鹽霉素(16μM)作用CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP細(xì)胞48h后其凋亡率分別為36.2%、32.1%、33.4%。 5.熒光分光光度計(jì)法檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,鹽霉素作用于人鼻咽癌CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP細(xì)胞48h后,明顯增加了caspase-3和caspase-9活性,且呈劑量依賴性,然而對(duì)caspase-8影響不大。當(dāng)16μM的鹽霉素作用鼻咽癌CNE-1細(xì)胞48h后,caspase-3的活性增加高達(dá)5倍。 6.線粒體膜電位(MMP)通過JC-1染色及流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)。通過比較代表正常線粒體條件下的紅色熒光(FL2-H)和代表被破壞線粒體的綠色熒光(FLl-H)的比值比來對(duì)MMP進(jìn)行量化。按照J(rèn)C-1試劑盒說明書,我們檢測(cè)到,相比對(duì)照組,鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞后能降低MMP,說明鹽霉素作用后的細(xì)胞線粒體活性受損。 7. Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,鹽霉素作用于人鼻咽癌CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP細(xì)胞48h后,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量下降,促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量增加,且均呈劑量依賴性,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；此外,在相同藥物作用條件下,我們探討了Wnt家族的關(guān)鍵靶分子蛋白β-catenin及LRP6的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,這兩個(gè)蛋白的表達(dá)量均下降,且呈劑量依賴性。 8.體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)可觀察到,通過測(cè)量移植瘤的體積大小,我們可以看到相比對(duì)照組,藥物治療組的腫瘤生長(zhǎng)變慢,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)過兩周的藥物治療,實(shí)驗(yàn)被終止,剝離瘤體,稱重量,可以發(fā)現(xiàn),藥物治療組的瘤體比對(duì)照組要小,差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。通過HE染色及免疫組化技術(shù),我們分別檢測(cè)了兩組瘤體組織中β-catenin蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示藥物治療組中的β-catenin蛋白表達(dá)比對(duì)照組低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0,05)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 鹽霉素可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力。在體外,鹽霉素能阻斷Bcl-2/Bax復(fù)合物,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率的增加、caspase-3and caspase-9激活以及線粒體膜電位的下降。此外,鹽霉素在體外能降低β-catenin and LRP6蛋白的表達(dá),在體內(nèi)能抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng),降低組織中P-catenin蛋白表達(dá)。因此我們認(rèn)為鹽霉素在體內(nèi)外都能抗鼻咽癌細(xì)胞,這一過程可能為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制所介導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】：鹽霉素 鼻咽癌 凋亡 Wnt/β-catenin信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 第一章 前言17-22
• 第二章 材料與方法22-39
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 材料與主要試劑22
• 2.1.2 儀器設(shè)備22-23
• 2.2 方法23-39
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)23-24
• 2.2.2 CCK-8法測(cè)定鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞后細(xì)胞增殖情況24
• 2.2.3 侵襲實(shí)驗(yàn)觀察鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞48h后細(xì)胞侵襲能力的變化24-25
• 2.2.4 Hoechst 33258染色觀察鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞后細(xì)胞凋亡形態(tài)25
• 2.2.5 FCM檢測(cè)鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率的變化25-26
• 2.2.6 熒光分光光度計(jì)觀察鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞后caspases酶活性的變化26
• 2.2.7 FCM檢測(cè)鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞后線粒體膜電位的變化26-27
• 2.2.8 Western Blotting檢測(cè)鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞后Bcl-2、Bax、LRP6、β-catenin蛋白表達(dá)情況的變化27-33
• 2.2.9 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察鹽霉素對(duì)鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制情況33-38
• 2.2.10 統(tǒng)計(jì)方法38-39
• 第三章 結(jié)果39-49
• 3.1 CCK-8檢測(cè)鹽霉素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用39-40
• 3.2 侵襲實(shí)驗(yàn)觀察鹽霉素作用于人鼻咽癌CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP細(xì)胞后侵襲能力的影響40
• 3.3 Hoechst33258熒光染色觀察鹽霉素作用于人鼻咽癌CNE-1、CNE-2、CNE-2/DDP細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響40-41
• 3.4 FCM檢測(cè)鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率的變化41-43
• 3.5 熒光分光光度計(jì)觀察鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞后caspases酶活性的變化.43
• 3.6 FCM檢測(cè)鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞后線粒體膜電位的變化43-44
• 3.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)鹽霉素作用鼻咽癌細(xì)胞后Bcl-2、Bax、LRP6,、β-catenin蛋白表達(dá)情況的變化44-46
• 3.8 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察鹽霉素對(duì)鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制情況46-49
• 第四章 討論49-54
• 第五章 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 在讀期間論文發(fā)表情況63-64
• 致謝64-65

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張瑜;林志安;潘建基;鄭茁;楊凌;林少俊;鄭飛;;初治鼻咽癌調(diào)強(qiáng)放療與常規(guī)放療的同期對(duì)照研究[J];癌癥;2009年11期

2 李智,任藝,林素暇,梁英杰,梁惠珍;Association of E-cadherin and β-catenin with metastasis in nasopharyngeal carcinoma[J];Chinese Medical Journal;2004年08期

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本文編號(hào)：818955