發(fā)布時(shí)間：2017-09-08 19:09

  本文關(guān)鍵詞：糖尿病大鼠玻璃體腔移植不同濃度人臍帶間充干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的 觀察玻璃體腔移植不同濃度人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical mesenchymal stem cells, hUCMSCs)后糖尿病(diabetes mellitus, DM)大鼠視網(wǎng)膜功能變化及視網(wǎng)膜神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)的表達(dá)情況,觀察比較移植不同濃度hUCMSCs對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)治療的療效差異,進(jìn)一步證明治療DR的最佳hUCMSCs濃度,探討hUCMSCs治療DR的可能機(jī)制。 方法 健康成年雄性SD大鼠48只,隨機(jī)分成正常對(duì)照組(A組)和DM組,分別為10、38只。鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)尾靜脈注射制作SD大鼠DR模型。將DM組大鼠隨機(jī)分為DR組(B組)、玻璃體腔注射高濃度(1*10^,6～7)hUCMSCs2μL組(C組),玻璃體腔注射低濃度(1*10^5～6)hUCMSCs2μL組(D組),玻璃體腔注射安慰劑2μL組(E組)。正常對(duì)照組(A組,10只)和B組無處理。成模后每2-4w進(jìn)行血糖監(jiān)測(cè)。用溴化乙錠(Evans blue, EB)染色視網(wǎng)膜鋪片,熒光顯微鏡觀察視網(wǎng)膜血管的變化情況：蘇木精-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化；免疫組織化學(xué)法觀察視網(wǎng)膜NGF陽性染色的情況,Image-Pro Plus6.0圖像處理分析軟件分析各組染色區(qū)的平均累積光密度(integrated optic density, IOD);用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR)檢測(cè)視網(wǎng)膜中NGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件,組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.血糖水平監(jiān)測(cè)：STZ尾靜脈注射一周后,測(cè)得正常對(duì)照組大鼠平均血糖值為(5.43±0.81) mmol/L,糖尿病組大鼠血糖值為(27.59±3.56) mmol/L.在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得DM大鼠血糖水平較高,但基本保持在一個(gè)穩(wěn)定水平；與同期正常對(duì)照組大鼠相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.01) 2.體質(zhì)量監(jiān)測(cè)：大鼠造模成功時(shí)體質(zhì)量于正常對(duì)照組大鼠相似,二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.805,P=0.433)。造模成功后正常對(duì)照組大鼠隨著周齡的增加體質(zhì)量增長(zhǎng)較快,DM大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度較正常對(duì)照組減緩,周齡越長(zhǎng),體質(zhì)量相差越大,不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得兩組體質(zhì)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.01)。 3.EB染色視網(wǎng)膜鋪片：A組正常大鼠視網(wǎng)膜血管走形良好,血管管壁平滑,視網(wǎng)膜淺層大血管及深層血管網(wǎng)均清晰可見,未見視網(wǎng)膜微血管瘤和視網(wǎng)膜新生血管形成。DM大鼠視網(wǎng)膜血管走形迂曲、擴(kuò)張,視網(wǎng)膜上可見微動(dòng)脈瘤,血管呈串珠樣改變,血管周圍可見高熒光滲漏及周邊視網(wǎng)膜可見大片無灌注區(qū)。 4.HE染色：A組正常大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)整齊分明,細(xì)胞形態(tài)基本正常。內(nèi)界膜完整清晰；神經(jīng)纖維層(nerve fiber layer, NFL)較稀疏呈水平排列；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer, GCL)排列整齊,胞核較大,呈圓形或橢圓形,染色較淡；內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer, IPL)較厚,呈較明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；內(nèi)核層(inner nuclear layer, INL)細(xì)胞胞核較大,染色稍深；外從狀層(outer plexiform layer, OPL)比內(nèi)從狀層偏薄；外核層(outer nuclear layer, ONL)由多層細(xì)胞排列組成,染色深排列緊密；光感受器細(xì)胞層(photoreceptor cell layer,PRL)內(nèi)外節(jié)形態(tài)規(guī)整。B組、E組大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂,節(jié)細(xì)胞等各層細(xì)胞數(shù)減少,內(nèi)界膜不完整,視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,新生血管芽呈垂直狀突破內(nèi)界膜生長(zhǎng),出現(xiàn)早期新生血管(neovascularization, NV)表現(xiàn)。C組、D組各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列較紊亂,各層細(xì)胞數(shù)目相對(duì)較少,可見內(nèi)界膜局部不完整。 5.免疫組織化學(xué)染色：A組：NGF表達(dá)呈陽性,陽性細(xì)胞邊界較清晰,主要位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)層, IPL、OPL、外界膜、色素上皮層,INL和ONL僅有少量表達(dá)。B、E組：2W時(shí)NGF表達(dá)呈陽性,各層表達(dá)量增加,陽性著色較深。4W時(shí)NGF陽性表達(dá)開始減弱,各層表達(dá)量減少。8W時(shí)NGF陽性表達(dá)顯著減少,各層陽性染色均較淺。C、D組：2W時(shí)NGF表達(dá)增多,隨著時(shí)間的推移,NGF陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng),8W時(shí)達(dá)到高峰,C組更為明顯,染色更深。 6. RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜NGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量：2w時(shí)4個(gè)DR組間視網(wǎng)膜NGF mRNA表達(dá)差異無顯著性(F=0.163,P=0.920),其他時(shí)間點(diǎn)相比差異均具有顯著性(F=13.737,25.060,123.277, P均為0.000)。4w、6w、8w時(shí)B組與E組NGF mRAN相比差異無顯著性(P=0.703,P=0.801,P=0.819),與C組、D組相比差異具有顯著性(P0.05)。4w、6w時(shí)C組、D組相比差異無顯著性(P=0.542,0.801),8w時(shí)C組與D組相比差異有顯著性(P0.05)。 結(jié)論 1.STZ誘導(dǎo)的DM大鼠,是模擬糖尿病視網(wǎng)膜病變的一種可靠的動(dòng)物模型； 2.DR早期即會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜各層細(xì)胞造成損傷； 3.DR早期引起NGF的表達(dá)升高,隨著時(shí)間的推移NGF表達(dá)呈下降趨勢(shì),視網(wǎng)膜神經(jīng)功能減退； 4.玻璃體腔注射hUCMSCs可改善DR視網(wǎng)膜功能,增加NGF的表達(dá),改善視網(wǎng)膜功能； 5.高濃度hUCMSCs對(duì)DR的保護(hù)效果要優(yōu)于低濃度hUCMSCs的效果。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病視網(wǎng)膜病變 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 神經(jīng)生長(zhǎng)因子 干細(xì)胞治療
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R774.1;R587.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 目錄10-12
• ~.略語12-14
• 前言14-18
• 研究現(xiàn)狀、成果14-17
• 研究目的、方法17-18
• 對(duì)象和方法18-29
• 1 對(duì)象18-20
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18
• 1.2 主要儀器設(shè)備18-19
• 1.3 主要試劑19-20
• 1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制20
• 2 方法20-29
• 2.1 建立動(dòng)物模型20-21
• 2.2 動(dòng)物分組21
• 2.3 EB染色視網(wǎng)膜鋪片21-22
• 2.4 玻璃體腔注射22-23
• 2.5 石蠟切片及HE染色及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NGF蛋白的表達(dá)23-24
• 2.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NGF蛋白的表達(dá)(SP法)24-25
• 2.7 RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜NGF mRNA的表達(dá)25-28
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析28-29
• 結(jié)果29-42
• 1 DM大鼠全身情況29-32
• 1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況29-30
• 1.2 分組30
• 1.3 血糖及體質(zhì)量變化30-32
• 2 EB染色視網(wǎng)膜鋪片32-33
• 3 大鼠視網(wǎng)膜HE染色切片觀察33-34
• 4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)視網(wǎng)膜NGF蛋白的表達(dá)變化34-39
• 5 RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜NGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量39-42
• 5.1 RNA純度鑒定39
• 5.2 RNA完整性鑒定39
• 5.3 RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜NGF mRNA的表達(dá)39-42
• 討論42-48
• 1 動(dòng)物模型的建立42
• 2 DM早期組織病理學(xué)變化42-43
• 3 NGF在DR中的作用43-45
• 4 移植途徑45-46
• 5 hUCMSCs治療DM造成的神經(jīng)退行性改變的可能性46-47
• 6 hUC-MSCs移植濃度的選擇47-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明53-54
• 綜述54-64
• 綜述參考文獻(xiàn)60-64
• 致謝64

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 宋鄂,呂成芳,齊曉同,董宇,王心蕊,吳家祥;糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病理模型的建立[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年03期

2 盛曉蓉;糖尿病大鼠建模觀察[J];九江醫(yī)學(xué);1998年01期

3 康強(qiáng)軍;劉長(zhǎng)安;王江泳;王保芝;;不同密度骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)家兔股骨頭缺血性壞死的治療作用[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2010年01期

4 靳秋分;丁淑華;;糖尿病性視網(wǎng)膜病變的相關(guān)危險(xiǎn)因素分析及治療近況[J];中醫(yī)學(xué)報(bào);2013年01期

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本文編號(hào)：815792