發(fā)布時間：2017-09-03 18:31

  本文關(guān)鍵詞：膽紅素對離體培養(yǎng)新生大鼠耳蝸組織毒性作用研究

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【摘要】：黃疸是新生兒比較常見的現(xiàn)象,一般不會造成病理損害,但是當(dāng)血液中膽紅素過度升高時就會影響健康并導(dǎo)致一系列的神經(jīng)功能紊亂,其中聽力障礙是最常見的新生兒高膽紅素血癥后遺癥。多中心流行病學(xué)調(diào)查表明,聽神經(jīng)病與嬰幼兒時期發(fā)生高膽紅素血癥有極強的相關(guān)性,但膽紅素引起聽神經(jīng)病的具體機制還不是很清楚。為了更直觀的揭示膽紅素對外周聽覺器官的毒性作用部位,本研究對體外培養(yǎng)的新生大鼠耳蝸基底膜組織及螺旋神經(jīng)節(jié)進行了膽紅素處理,并觀察不同濃度的膽紅素以及同一濃度不同作用時長下其各個部位毒性效應(yīng)。 第一部分:不同膽紅素濃度對大鼠耳蝸組織的損傷效應(yīng) 目的觀察不同濃度膽紅素對離體培養(yǎng)大鼠耳蝸組織的損傷效應(yīng) 方法健康新生3日齡SD大鼠25只,雌雄不限,分離其雙側(cè)的內(nèi)耳,共得到附帶有螺旋神經(jīng)節(jié)的耳蝸基底膜組織50個。體外培養(yǎng)12h后換含5%FBS培養(yǎng)基；取材后48h,倒置顯微鏡觀察,選擇狀態(tài)良好、有成纖維爬出的基底膜40個入選實驗,并將其隨機分為4組：對照組；實驗組：10μmol/L組,50μmol/L組,100μmol/L組,每組各10個標本。分組完畢后開始進行藥物處理,試驗組每個細胞培養(yǎng)皿中按分組濃度加入膽紅素溶液,對照組加入相應(yīng)體積的生理鹽水。所有的標本均在藥物處理后24h終止培養(yǎng)并對其進行固定、免疫組織化學(xué)染色,共聚焦顯微鏡觀察。 結(jié)果10μmol/L的膽紅素對離體培養(yǎng)的耳蝸組織作用24h時無明顯毒性作用,50μmol/L膽紅素組中螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元有明顯減少,內(nèi)外毛細胞形態(tài)及數(shù)量完整；100μmol/L組中耳蝸組織的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元幾乎完全消失,內(nèi)、外毛細胞也都發(fā)生了損傷。 結(jié)論膽紅素對耳蝸組織的損傷效應(yīng)呈濃度依賴性,且膽紅素首先損害的部位是螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元,當(dāng)藥物濃度繼續(xù)增大時,毛細胞也會受到損傷。 第二部分:耳蝸組織受損效應(yīng)與膽紅素作用時同的關(guān)系 目的觀察膽紅素對離體培養(yǎng)的新生SD大鼠耳蝸組織損傷的的時間依賴性 方法健康新生3日齡SD大鼠35只,雌雄不限,分離每組動物的內(nèi)耳共得到附帶有螺旋神經(jīng)節(jié)的耳蝸組織70個,原代取材培養(yǎng)12h后換含5%FBS培養(yǎng)基；取材后48h,觀察組織貼壁、存活良好的60個耳蝸組織入選實驗,并將所有組織隨機分為六組：24h對照組,24h膽紅素組,48h對照組,48h膽紅素組,72h對照組,72h膽紅素組(每組各10個)；試驗組每個細胞培養(yǎng)皿中膽紅素終濃度為50μmol/L,對照組加入相應(yīng)體積的生理鹽水。三個試驗組分別用藥24h、48h、72h終止培養(yǎng),對照組亦分別在上述時間點取樣,并對其進行固定、免疫組織化學(xué)染色,之后共聚焦顯微鏡觀察耳蝸組織中毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)變化并計數(shù)、統(tǒng)計對比。 結(jié)果膽紅素作用24h時,離體培養(yǎng)的耳蝸組織中螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞體及其樹突纖維即有明顯的減少,內(nèi)外毛細胞形態(tài)及數(shù)量完整；隨著膽紅素作用時間的延長,48h時神經(jīng)元減少更加明顯,底回的外毛細胞開始出現(xiàn)缺失；72h時神經(jīng)元幾乎消失殆盡,底回及中回外毛細胞減少明顯,底回內(nèi)毛細胞也發(fā)生了數(shù)量的減少。同時我們觀察到,三個時間點的對照組之間無明顯差異。在同樣的膽紅素作用時長下(24h),當(dāng)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元已經(jīng)發(fā)生明顯的數(shù)量下降時,內(nèi)外毛細胞數(shù)量缺失不明顯,這說明毛細胞與螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元相比,其對膽紅素的毒性相對不敏感；但隨著膽紅素作用時間的延長(48h及72h),毛細胞也會受到損傷,并且外毛細胞首先出現(xiàn)缺失,內(nèi)毛細胞相對更能耐受膽紅素毒性。 結(jié)論1.膽紅素對螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的損傷作用具有時間依賴性；2.螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元比內(nèi)外毛細胞對膽紅素的毒性作用敏感。 第三部分膽紅素作用下螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元caspase-3的表達及其調(diào)亡過程觀案 目的探討膽紅素對螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的毒性作用方式 方法健康新生3日齡SD大鼠23只,雌雄不限,分離內(nèi)耳組織共得到附帶有螺旋神經(jīng)節(jié)的耳蝸基底膜組織46個,原代取材培養(yǎng)12h后換含5%FBS培養(yǎng)基；取材后48h,觀察組織貼壁、存活良好的40個耳蝸組織入選實驗,并將所有組織隨機分為四組：12h對照組,12h藥物組,24h藥物組,48h藥物組(每組各10個)；分組完畢后開始進行藥物處理,試驗組每個細胞培養(yǎng)皿中膽紅素終濃度為50μml/L,對照組加入相應(yīng)體積的生理鹽水。各組分別在用藥12h、18h、36h終止培養(yǎng),并對其進行固定、免疫組織化學(xué)染色、對比,之后共聚焦顯微鏡觀察螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中caspase-3的表達情況及胞體形態(tài)變化。 結(jié)果膽紅素作用12h時caspase-3高表達,18h時即出現(xiàn)了大量的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞體的崩解破碎,大量胞體蛋白碎屑殘留；36h時,神經(jīng)元胞體數(shù)量明顯減少,其樹突神經(jīng)纖維也減少明顯,Ⅰ型神經(jīng)元與Ⅱ型神經(jīng)元相比減少更甚。 結(jié)論膽紅素能夠激活螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞凋亡程序,引起胞體中caspase-3凋亡蛋白的表達,Ⅰ型神經(jīng)元與Ⅱ型神經(jīng)元相比凋亡更明顯。
【關(guān)鍵詞】：耳蝸組織 離體培養(yǎng) 膽紅素 螺旋神經(jīng)節(jié) 毛細胞 耳蝸組織 離體培養(yǎng) 膽紅素 螺旋神經(jīng)節(jié) 毛細胞
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R764.431
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 中英文縮略詞表12-13
• 前言13-14
• 第一部分 不同膽紅素濃度對耳蝸組織的損傷效應(yīng)14-26
• 材料和方法14-18
• 1 材料14-15
• 1.1 實驗動物14
• 1.2 實驗試劑14
• 1.3 實驗儀器及器械14-15
• 2 方法15-18
• 2.1 試劑的配制15-16
• 2.2 耳蝸組織取材及培養(yǎng)方法16
• 2.3 分組及藥物應(yīng)用方法16-17
• 2.4 免疫熒光染色17
• 2.5 纖毛染色17
• 2.6 統(tǒng)計學(xué)分析方法17-18
• 結(jié)果18-24
• 討論24-25
• 結(jié)論25-26
• 第二部分 耳蝸組織受損效應(yīng)與膽紅素作用時間的關(guān)系26-38
• 材料與方法26-30
• 1 材料26-27
• 1.1 實驗動物26
• 1.2 實驗試劑26-27
• 1.3 實驗儀器及器械27
• 2 方法27-30
• 2.1 試劑的配制27-28
• 2.2 耳蝸組織取材及培養(yǎng)方法28
• 2.3 分組及藥物應(yīng)用方法28-29
• 2.4 免疫熒光染色29
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析方法29-30
• 結(jié)果30-36
• 討論36-37
• 結(jié)論37-38
• 第三部分 膽紅素作用下螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元caspase-3的表達及其凋亡過程觀察38-45
• 材料和方法38-41
• 1 材料38-39
• 1.1 實驗動物38
• 1.2 實驗試劑38-39
• 1.3 實驗儀器及器械39
• 2 方法39-41
• 2.1 培養(yǎng)液及膠體的配制39-40
• 2.2 耳蝸組織取材及培養(yǎng)方法40
• 2.3 分組及藥物應(yīng)用方法40-41
• 2.4 標本的固定及免疫熒光染色41
• 結(jié)果41-43
• 討論43-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-46
• 論文結(jié)論與展望46-47
• 文獻綜述47-55
• 1 膽紅素代謝及其致病性47
• 2 膽紅素對聽覺系統(tǒng)損害的研究47-51
• 2.1 高膽紅素血癥是聽神經(jīng)病的高危因素之一47-48
• 2.2 聽覺通路病變定位的研究48
• 2.3 膽紅素神經(jīng)毒性的分子機制48-51
• 3 高膽紅素血癥致聽神經(jīng)病的防治51-52
• 3.1 高膽紅素血癥的干預(yù)51
• 3.2 聽神經(jīng)病的預(yù)防及早期發(fā)現(xiàn)51-52
• 3.3 聽神經(jīng)病的干預(yù)措施52
• 4 高膽紅素血癥致聽神經(jīng)病治療展望52-53
• 參考文獻53-55
• 碩士在讀期間發(fā)表及已完成的論文55-56
• 致謝56-57

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會新生兒學(xué)組,葉鴻瑁,丁國芳;全國新生兒黃疸與感染學(xué)術(shù)研討會紀要(附新生兒黃疸干預(yù)推薦方案)[J];中華兒科雜志;2001年03期

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本文編號：786665