本文關(guān)鍵詞：膽紅素對(duì)離體培養(yǎng)新生大鼠耳蝸組織毒性作用研究

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【摘要】：黃疸是新生兒比較常見(jiàn)的現(xiàn)象,一般不會(huì)造成病理?yè)p害,但是當(dāng)血液中膽紅素過(guò)度升高時(shí)就會(huì)影響健康并導(dǎo)致一系列的神經(jīng)功能紊亂,其中聽(tīng)力障礙是最常見(jiàn)的新生兒高膽紅素血癥后遺癥。多中心流行病學(xué)調(diào)查表明,聽(tīng)神經(jīng)病與嬰幼兒時(shí)期發(fā)生高膽紅素血癥有極強(qiáng)的相關(guān)性,但膽紅素引起聽(tīng)神經(jīng)病的具體機(jī)制還不是很清楚。為了更直觀的揭示膽紅素對(duì)外周聽(tīng)覺(jué)器官的毒性作用部位,本研究對(duì)體外培養(yǎng)的新生大鼠耳蝸基底膜組織及螺旋神經(jīng)節(jié)進(jìn)行了膽紅素處理,并觀察不同濃度的膽紅素以及同一濃度不同作用時(shí)長(zhǎng)下其各個(gè)部位毒性效應(yīng)。 第一部分:不同膽紅素濃度對(duì)大鼠耳蝸組織的損傷效應(yīng) 目的觀察不同濃度膽紅素對(duì)離體培養(yǎng)大鼠耳蝸組織的損傷效應(yīng) 方法健康新生3日齡SD大鼠25只,雌雄不限,分離其雙側(cè)的內(nèi)耳,共得到附帶有螺旋神經(jīng)節(jié)的耳蝸基底膜組織50個(gè)。體外培養(yǎng)12h后換含5%FBS培養(yǎng)基；取材后48h,倒置顯微鏡觀察,選擇狀態(tài)良好、有成纖維爬出的基底膜40個(gè)入選實(shí)驗(yàn),并將其隨機(jī)分為4組：對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組：10μmol/L組,50μmol/L組,100μmol/L組,每組各10個(gè)標(biāo)本。分組完畢后開(kāi)始進(jìn)行藥物處理,試驗(yàn)組每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中按分組濃度加入膽紅素溶液,對(duì)照組加入相應(yīng)體積的生理鹽水。所有的標(biāo)本均在藥物處理后24h終止培養(yǎng)并對(duì)其進(jìn)行固定、免疫組織化學(xué)染色,共聚焦顯微鏡觀察。 結(jié)果10μmol/L的膽紅素對(duì)離體培養(yǎng)的耳蝸組織作用24h時(shí)無(wú)明顯毒性作用,50μmol/L膽紅素組中螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元有明顯減少,內(nèi)外毛細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量完整；100μmol/L組中耳蝸組織的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元幾乎完全消失,內(nèi)、外毛細(xì)胞也都發(fā)生了損傷。 結(jié)論膽紅素對(duì)耳蝸組織的損傷效應(yīng)呈濃度依賴(lài)性,且膽紅素首先損害的部位是螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元,當(dāng)藥物濃度繼續(xù)增大時(shí),毛細(xì)胞也會(huì)受到損傷。 第二部分:耳蝸組織受損效應(yīng)與膽紅素作用時(shí)同的關(guān)系 目的觀察膽紅素對(duì)離體培養(yǎng)的新生SD大鼠耳蝸組織損傷的的時(shí)間依賴(lài)性 方法健康新生3日齡SD大鼠35只,雌雄不限,分離每組動(dòng)物的內(nèi)耳共得到附帶有螺旋神經(jīng)節(jié)的耳蝸組織70個(gè),原代取材培養(yǎng)12h后換含5%FBS培養(yǎng)基；取材后48h,觀察組織貼壁、存活良好的60個(gè)耳蝸組織入選實(shí)驗(yàn),并將所有組織隨機(jī)分為六組：24h對(duì)照組,24h膽紅素組,48h對(duì)照組,48h膽紅素組,72h對(duì)照組,72h膽紅素組(每組各10個(gè))；試驗(yàn)組每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中膽紅素終濃度為50μmol/L,對(duì)照組加入相應(yīng)體積的生理鹽水。三個(gè)試驗(yàn)組分別用藥24h、48h、72h終止培養(yǎng),對(duì)照組亦分別在上述時(shí)間點(diǎn)取樣,并對(duì)其進(jìn)行固定、免疫組織化學(xué)染色,之后共聚焦顯微鏡觀察耳蝸組織中毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)變化并計(jì)數(shù)、統(tǒng)計(jì)對(duì)比。 結(jié)果膽紅素作用24h時(shí),離體培養(yǎng)的耳蝸組織中螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞體及其樹(shù)突纖維即有明顯的減少,內(nèi)外毛細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量完整；隨著膽紅素作用時(shí)間的延長(zhǎng),48h時(shí)神經(jīng)元減少更加明顯,底回的外毛細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)缺失；72h時(shí)神經(jīng)元幾乎消失殆盡,底回及中回外毛細(xì)胞減少明顯,底回內(nèi)毛細(xì)胞也發(fā)生了數(shù)量的減少。同時(shí)我們觀察到,三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。在同樣的膽紅素作用時(shí)長(zhǎng)下(24h),當(dāng)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元已經(jīng)發(fā)生明顯的數(shù)量下降時(shí),內(nèi)外毛細(xì)胞數(shù)量缺失不明顯,這說(shuō)明毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元相比,其對(duì)膽紅素的毒性相對(duì)不敏感；但隨著膽紅素作用時(shí)間的延長(zhǎng)(48h及72h),毛細(xì)胞也會(huì)受到損傷,并且外毛細(xì)胞首先出現(xiàn)缺失,內(nèi)毛細(xì)胞相對(duì)更能耐受膽紅素毒性。 結(jié)論1.膽紅素對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的損傷作用具有時(shí)間依賴(lài)性；2.螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元比內(nèi)外毛細(xì)胞對(duì)膽紅素的毒性作用敏感。 第三部分膽紅素作用下螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元caspase-3的表達(dá)及其調(diào)亡過(guò)程觀案 目的探討膽紅素對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的毒性作用方式 方法健康新生3日齡SD大鼠23只,雌雄不限,分離內(nèi)耳組織共得到附帶有螺旋神經(jīng)節(jié)的耳蝸基底膜組織46個(gè),原代取材培養(yǎng)12h后換含5%FBS培養(yǎng)基；取材后48h,觀察組織貼壁、存活良好的40個(gè)耳蝸組織入選實(shí)驗(yàn),并將所有組織隨機(jī)分為四組：12h對(duì)照組,12h藥物組,24h藥物組,48h藥物組(每組各10個(gè))；分組完畢后開(kāi)始進(jìn)行藥物處理,試驗(yàn)組每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中膽紅素終濃度為50μml/L,對(duì)照組加入相應(yīng)體積的生理鹽水。各組分別在用藥12h、18h、36h終止培養(yǎng),并對(duì)其進(jìn)行固定、免疫組織化學(xué)染色、對(duì)比,之后共聚焦顯微鏡觀察螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中caspase-3的表達(dá)情況及胞體形態(tài)變化。 結(jié)果膽紅素作用12h時(shí)caspase-3高表達(dá),18h時(shí)即出現(xiàn)了大量的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞體的崩解破碎,大量胞體蛋白碎屑?xì)埩簦?6h時(shí),神經(jīng)元胞體數(shù)量明顯減少,其樹(shù)突神經(jīng)纖維也減少明顯,Ⅰ型神經(jīng)元與Ⅱ型神經(jīng)元相比減少更甚。 結(jié)論膽紅素能夠激活螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡程序,引起胞體中caspase-3凋亡蛋白的表達(dá),Ⅰ型神經(jīng)元與Ⅱ型神經(jīng)元相比凋亡更明顯。
【關(guān)鍵詞】：耳蝸組織 離體培養(yǎng) 膽紅素 螺旋神經(jīng)節(jié) 毛細(xì)胞 耳蝸組織 離體培養(yǎng) 膽紅素 螺旋神經(jīng)節(jié) 毛細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R764.431
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 中英文縮略詞表12-13
• 前言13-14
• 第一部分 不同膽紅素濃度對(duì)耳蝸組織的損傷效應(yīng)14-26
• 材料和方法14-18
• 1 材料14-15
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑14
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及器械14-15
• 2 方法15-18
• 2.1 試劑的配制15-16
• 2.2 耳蝸組織取材及培養(yǎng)方法16
• 2.3 分組及藥物應(yīng)用方法16-17
• 2.4 免疫熒光染色17
• 2.5 纖毛染色17
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法17-18
• 結(jié)果18-24
• 討論24-25
• 結(jié)論25-26
• 第二部分 耳蝸組織受損效應(yīng)與膽紅素作用時(shí)間的關(guān)系26-38
• 材料與方法26-30
• 1 材料26-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑26-27
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及器械27
• 2 方法27-30
• 2.1 試劑的配制27-28
• 2.2 耳蝸組織取材及培養(yǎng)方法28
• 2.3 分組及藥物應(yīng)用方法28-29
• 2.4 免疫熒光染色29
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法29-30
• 結(jié)果30-36
• 討論36-37
• 結(jié)論37-38
• 第三部分 膽紅素作用下螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元caspase-3的表達(dá)及其凋亡過(guò)程觀察38-45
• 材料和方法38-41
• 1 材料38-39
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物38
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑38-39
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及器械39
• 2 方法39-41
• 2.1 培養(yǎng)液及膠體的配制39-40
• 2.2 耳蝸組織取材及培養(yǎng)方法40
• 2.3 分組及藥物應(yīng)用方法40-41
• 2.4 標(biāo)本的固定及免疫熒光染色41
• 結(jié)果41-43
• 討論43-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-46
• 論文結(jié)論與展望46-47
• 文獻(xiàn)綜述47-55
• 1 膽紅素代謝及其致病性47
• 2 膽紅素對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損害的研究47-51
• 2.1 高膽紅素血癥是聽(tīng)神經(jīng)病的高危因素之一47-48
• 2.2 聽(tīng)覺(jué)通路病變定位的研究48
• 2.3 膽紅素神經(jīng)毒性的分子機(jī)制48-51
• 3 高膽紅素血癥致聽(tīng)神經(jīng)病的防治51-52
• 3.1 高膽紅素血癥的干預(yù)51
• 3.2 聽(tīng)神經(jīng)病的預(yù)防及早期發(fā)現(xiàn)51-52
• 3.3 聽(tīng)神經(jīng)病的干預(yù)措施52
• 4 高膽紅素血癥致聽(tīng)神經(jīng)病治療展望52-53
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 碩士在讀期間發(fā)表及已完成的論文55-56
• 致謝56-57

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)新生兒學(xué)組,葉鴻瑁,丁國(guó)芳;全國(guó)新生兒黃疸與感染學(xué)術(shù)研討會(huì)紀(jì)要(附新生兒黃疸干預(yù)推薦方案)[J];中華兒科雜志;2001年03期

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本文編號(hào)：786665