本文關(guān)鍵詞：順鉑對小鼠耳蝸內(nèi)毛細胞形態(tài)及otoferlin蛋白表達的影響

  更多相關(guān)文章： 順鉑 內(nèi)毛細胞 otoferlin蛋白 ABR

【摘要】：背景及研究目的： 順鉑是一種高效的化療藥，在臨床上被廣泛用于抗腫瘤治療，包括生殖細胞腫瘤、鼻咽癌、肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及睪丸癌等[1]。然而，該藥也存在許多不良反應，如耳毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性等。在使用順鉑化療的病人中，高達93%的患者可以出現(xiàn)感音神經(jīng)性聾[2]，對于順鉑造成的耳毒性，目前尚無有效的治療方法。因此，對于順鉑造成的耳毒性機制研究十分重要。有研究發(fā)現(xiàn)順鉑進入耳蝸后首先被毛細胞攝取，而支持細胞攝取順鉑的能力相對較弱[3]，這就提示毛細胞可能是聽功能損傷的主要靶細胞。 內(nèi)耳毛細胞是真正的感覺細胞，它將聲音信息傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。內(nèi)毛細胞突觸是一種感覺信息損失最小的模擬系統(tǒng)[4]，具有亞毫秒級的精確度并且具有最高效率的囊泡釋放和回收的特點。內(nèi)毛細胞與傳入神經(jīng)末梢構(gòu)成特殊的帶狀突觸，otoferlin蛋白是內(nèi)毛細胞帶狀突觸上的功能蛋白，可以與synaptotagminI(突觸結(jié)合蛋白I)、胞漿磷脂酶A2、Ras相關(guān)的GTP結(jié)合蛋白等結(jié)合，它在胞膜運輸、信號傳遞及遞質(zhì)釋放等方面起著重要作用[5]。有研究表明在成熟小鼠耳蝸中該蛋白僅在內(nèi)毛細胞中高表達[6]，被認為是Ca2+感受器，與內(nèi)毛細胞胞吐過程密切相關(guān)，它的損傷可導致聽覺功能下降。 目前順鉑對聽功能損傷的具體機制尚不明確，主要存在兩種假說：一種假說認為順鉑作為一種高反應性分子，一旦進入內(nèi)耳細胞就可以通過水合反應轉(zhuǎn)化為更有活性的水分子形式結(jié)合許多生物大分子，如RNA、蛋白、膜磷脂、微絲及DNA等，進而造成聽力的損傷[7]。另一種假說認為，順鉑進入耳蝸細胞后，可激發(fā)產(chǎn)生大量的自由基[1]，這些自由基增多可引起毛細胞內(nèi)鈣離子濃度增高并導致毛細胞凋亡。以往的實驗主要研究順鉑對外毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的損傷，但是針對順鉑對內(nèi)毛細胞損傷的研究較少。本實驗主要研究順鉑尤其是低劑量順鉑對聽功能的損傷，以及其損傷是否與內(nèi)毛細胞本身及其功能蛋白otoferlin有關(guān)。因此，本研究內(nèi)容是建立低劑量順鉑聽覺損傷模型，觀察內(nèi)毛細胞形態(tài)變化及otoferlin蛋白的表達情況，豐富順鉑造成聽功能損傷的機制，并為臨床防護順鉑對聽功能的損傷提供新的實驗證據(jù)。同時為后續(xù)進一步研究otoferlin蛋白調(diào)節(jié)機制提供損傷模型。 方法： 1、將雄性C57小鼠(8周-12周齡)隨機分為7組，每組8只。分別為第一組：正常對照組，其余各組腹腔注射順鉑。第二組：順鉑的劑量為0.75mg/(kg×d)，連續(xù)注射4d；第三組：注射劑量為1.5mg/(kg×d)，連續(xù)注射4d；第四組：注射劑量為3.0mg/(kg×d)，連續(xù)注射4d；第五組：注射劑量為0.75mg/(kg×d)，連續(xù)注射7d；第六組：注射劑量為1.5mg/(kg×d)，連續(xù)注射7d；第七組：注射劑量為3.0mg/(kg×d)，連續(xù)注射7d。 2、小鼠聽性腦干反應(ABR)閾值測定：用藥結(jié)束后對各組小鼠聽閾進行測定，使用SPSS18.0軟件，采用t檢驗和單因素方差分析所得聽閾值，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義； 3、內(nèi)毛細胞形態(tài)學觀察：利用5%AgNO3耳蝸基底膜染色，于光學顯微鏡下觀察內(nèi)毛細胞形態(tài)變化，分別在不同劑量和不同時間點進行對比； 4、采用免疫熒光法、RT-PCR測定基底膜內(nèi)毛細胞otoferlin蛋白的表達，檢測順鉑對耳蝸內(nèi)毛細胞otoferlin蛋白表達的影響。 結(jié)果： 1、聽功能情況(ABR閾值)：同一時間對比中，用藥4天的實驗組與正常組比較，1.5mg/kg組和3.0mg/kg組存在明顯差異(P＜0.05)，且隨著劑量的增加，閾值增高越明顯；用藥7天的實驗組與正常組相比聽力均明顯下降(P＜0.05)，0.75mg/kg組和1.5mg/kg組平均值相同，3.0mg/kg組較前兩組閾值增高。同一劑量的情況下，0.75mg/kg×7d組比0.75mg/kg×4d組損傷更重(P＜0.05)，其余劑量造成的損傷在不同時間點無明顯差異。 2、內(nèi)毛細胞AgNO3染色：正常小鼠內(nèi)毛細胞呈圓形，大小均一，細胞間隙清楚，胞膜表面光滑，可觀察到呈“一”字型的纖毛；0.75mg/kg×4d組內(nèi)毛細胞呈橢圓形，大小無明顯改變，細胞間隙清楚，胞膜表面光滑，未見纖毛結(jié)構(gòu)；1.5mg/kg×4d組內(nèi)毛細胞呈橢圓形，大小無明顯改變，細胞間隙縮小，胞膜不光滑，未見纖毛結(jié)構(gòu)；3.0mg/kg×4d組內(nèi)毛細胞呈橢圓形，，體積明顯減小，細胞間隙縮小，細胞膜皺縮，未見纖毛結(jié)構(gòu)；0.75mg/kg×7d組內(nèi)毛細胞呈橢圓形，體積稍有減小，細胞間隙縮小，胞膜皺縮，未見纖毛結(jié)構(gòu)；1.5mg/kg×7d組內(nèi)毛細胞細胞呈橢圓形，體積縮小，細胞間隙不清，胞膜無法辨認，未見纖毛結(jié)構(gòu)；3.0mg/kg×7d組內(nèi)毛細胞細胞呈圓形，體積明顯縮小，細胞間隙明顯增寬，胞膜無法辨認。 3、otoferlin蛋白免疫熒光染色：正常小鼠內(nèi)毛細胞otoferlin綠色熒光表達均一完整，。隨著用藥劑量和時間的增加，otoferlin蛋白發(fā)生相應的改變，但DAPI標記的細胞核仍存在，即內(nèi)毛細胞未缺失。其中第7組(3.0mg/kg×7d)較正常組蛋白熒光灰度值明顯降低，即表達量明顯降低，其余各組無明顯區(qū)別，第3組(1.5mg/kg×4d)灰度值和第6組(1.5mg/kg×7d)較其他用藥組明顯升高。 4、otoferlin RT-PCR：0.75mg/kg與3.0mg/kg實驗組相比，RNA表達量均下降；而1.5mg/kg實驗組無明顯下降，余各實驗組之間無統(tǒng)計學差異。 結(jié)論： 1、成功建立了穩(wěn)定的低劑量順鉑損傷聽功能小鼠模型，發(fā)現(xiàn)順鉑損傷聽功能與時間和劑量相關(guān)，隨著用藥時間和劑量的增加，小鼠的聽力損傷逐漸加重；但0.75mg/(kg×d)×7d組和1.5mg/(kg×d)×7d組ABR閾值改變相同，考慮在一定損傷條件下可能會激發(fā)小鼠耳蝸自我保護功能； 2、順鉑可以造成內(nèi)毛細胞形態(tài)上不同程度的損傷； 3、免疫熒光圖片發(fā)現(xiàn)，順鉑可以造成otoferlin蛋白表達改變。隨劑量和時間不同，otoferlin蛋白表達亦不同，蛋白表達的變化與內(nèi)毛細胞形態(tài)改變并非同步關(guān)系。 4、綜上所述，順鉑造成的聽功能損傷與內(nèi)毛細胞有關(guān)，其損傷程度和劑量、時間呈相關(guān)性，即損傷越重內(nèi)毛細胞形態(tài)學改變越明顯；順鉑造成的聽功能損傷可能與內(nèi)毛細胞突觸蛋白otoferlin有關(guān)，但其損傷程度和劑量、時間不成正比性，并且和內(nèi)毛細胞形態(tài)學非同步性損傷�？紤]其原因可能是由于內(nèi)毛細胞中儲存的mRNA在順鉑的刺激下，增加了蛋白質(zhì)的合成，減緩聽功能的損傷。3.0mg/kg組的聽功能損傷加重且PCR結(jié)果表達下降，考慮為該劑量對內(nèi)毛細胞造成的損傷超過小鼠自我保護能力，順鉑可能從DNA、RNA、蛋白水平結(jié)合otoferlin，致使otoferlin蛋白合成減少。
【關(guān)鍵詞】：順鉑 內(nèi)毛細胞 otoferlin蛋白 ABR
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R764.43
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• Abstract5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 C57 小鼠聽功能損傷模型的建立15-23
• 2.1 材料與方法15-18
• 2.2 結(jié)果18-21
• 2.3 討論21-23
• 第三章 C57 小鼠內(nèi)毛細胞中 otoferlin 蛋白表達檢測23-33
• 3.1 材料與方法24-30
• 3.2 結(jié)果30-31
• 3.3 討論31-33
• 全文結(jié)論33-34
• 參考文獻34-37
• 文獻綜述 Otoferlin 蛋白在內(nèi)耳中的作用和機制探究37-51
• 參考文獻47-51
• 攻讀學位期間發(fā)表論文51-52
• 致謝52

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 蔡琴芳;蔣立新;;豚鼠耳蝸基底膜硝酸銀染色鋪片法的改良與觀察[J];聽力學及言語疾病雜志;2010年03期

2 丁大連;亓衛(wèi)東;張梅;王蘋;蔣海燕;Richard Salvi;;順鉑及其耳毒性[J];中華耳科學雜志;2008年02期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張鵬;尋常型銀屑病皮損組織全基因組DNA甲基化研究[D];中南大學;2012年

本文編號：765317