本文關(guān)鍵詞：外顯子組測(cè)序鑒定一個(gè)新的高度近視致病基因P4HA2

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【摘要】：背景：近視(Myopia)是一種眼睛屈光不正的狀態(tài),主要的特征為平行光線在黃斑中心凹的前面聚焦造成的視力模糊。近視可伴隨有眼底萎縮變性、視網(wǎng)膜脫落、黃斑出血,嚴(yán)重時(shí)甚至可至失明,是嚴(yán)重影響患者視力健康乃至生存質(zhì)量的一種重要疾病,在致盲眼病中居第6位。 目前已在多個(gè)不同民族和地區(qū)完成高度近視的全基因組掃描和遺傳連鎖分析。已經(jīng)定位的位點(diǎn)包括：1p36,2q37.1,3q26,4q12等。報(bào)道的相關(guān)致病基因包括：SCO2, LEPREL1, ZNF644,SLC39A5等。 目的：鑒定高度近視的致病基因。 方法：本研究所招募的高度近視家系(HM-SR3-2)由中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采集,患者均來(lái)自株洲。研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)為近視6000(-6.00OD)以上。該高度近視家系患者由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院眼科兩名主治以上�？漆t(yī)生共同診斷。該家系呈現(xiàn)典型的常染色體顯性遺傳趨勢(shì),患者表現(xiàn)為高度近視且進(jìn)行性加重。高度近視185例散發(fā)病人均由湘雅二醫(yī)院眼科收集,符合納入標(biāo)準(zhǔn)。我們?cè)贖M家系中選取兩個(gè)患者和一個(gè)正常人,應(yīng)用外顯子組測(cè)序的方法分析他們所有外顯子序列。然后我們運(yùn)用Sanger測(cè)序法在此家系中分別驗(yàn)證外顯子組測(cè)序的結(jié)果。運(yùn)用Sanger測(cè)序法在散發(fā)病人中進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。利用QPCR方法檢測(cè)病人淋巴細(xì)胞中mRNA表達(dá)。利用免疫印跡方法檢測(cè)病人淋巴細(xì)胞中蛋白水平變化。 結(jié)果：根據(jù)外顯子組測(cè)序結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)P4HA2基因c.871GA雜合突變?cè)诩蚁抵信c疾病共分離,且此突變位點(diǎn)未在209例正常人中發(fā)現(xiàn)。在185例散發(fā)患者中,發(fā)現(xiàn)P4HA2基因c.448AG, c.419AG, c.1349-1350delGT,c.1327AT雜合突變,且在300例正常人中未發(fā)現(xiàn)。QPCR結(jié)果提示,患者淋巴細(xì)胞中P4HA2mRNA表達(dá)量低于正常人,且在加入吐根堿之后達(dá)到正常人表達(dá)水平。Western blot的結(jié)果顯示,患者P4HA2蛋白表達(dá)量降低。 結(jié)論：該家系中患者均帶有P4HA2的c.871GA突變,該突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)p.291EK的改變,209例正常人無(wú)此突變；散發(fā)病人中發(fā)現(xiàn)P4HA2基因c.448AG, c.419A, c.1349-1350delGT, c.1327AT雜合突變,且在300例正常人中未發(fā)現(xiàn)；家系患者P4HA2mRNA發(fā)生提前降解,患者中由P4HA2編碼的蛋白4-脯氨酰羥化酶α亞基Ⅱ表達(dá)量降低；P4HA2基因可能是此高度近視家系的致病基因。
【關(guān)鍵詞】：高度近視 外顯子組測(cè)序 P4HA2
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R778.11
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 英文縮略詞表9-10
• 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材10-16
• 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞與DNA模板16-17
• 前言17-21
• 第一章 實(shí)驗(yàn)對(duì)象21-23
• 第二章 實(shí)驗(yàn)方法23-33
• 2.1 外周血DNA提取23
• 2.2 外顯子組測(cè)序23-25
• 2.3 PCR引物設(shè)計(jì)25-27
• 2.4 PCR反應(yīng)體系與條件27-28
• 2.5 淋巴細(xì)胞總RNA提取(使用Thermo GeneJET RNA Purification Kit)28
• 2.6 吐根堿(Emetine)處理淋巴細(xì)胞提取總RNA28-29
• 2.7 mRNA逆轉(zhuǎn)錄PCR29
• 2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR29-31
• 2.9 免疫印跡31-33
• 第三章 結(jié)果33-41
• 3.1 高度近視家系HM-SR-3外顯子組測(cè)序及驗(yàn)證33-36
• 3.2 P4HA2基因突變檢測(cè)36-37
• 3.3 突變蛋白預(yù)測(cè)37-38
• 3.4 患者淋巴細(xì)胞株P(guān)4HA2表達(dá)水平38-40
• 3.5 患者淋巴細(xì)胞株P(guān)4HB表達(dá)水平40-41
• 第四章 分析與討論41-44
• 第五章 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 綜述50-68
• 參考文獻(xiàn)58-68
• 致謝68-69
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷69

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