發(fā)布時間：2017-08-22 15:25

  本文關(guān)鍵詞：Orexin和組胺對舌下神經(jīng)運動神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用及其內(nèi)在機制

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【摘要】：[背景]阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome, OSAHS)是一種發(fā)病率極高的睡眠呼吸障礙性疾病,以上呼吸道的反復塌陷和慢性間歇低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)為特征。OSAHS患者正常睡眠節(jié)律嚴重破壞,睡眠中出現(xiàn)反復的覺醒。OSAHS的發(fā)病機制與睡眠時頦舌肌張力的下降有關(guān),特別是在REM睡眠時頦舌肌的張力降至最低。頦舌肌是調(diào)節(jié)上呼吸道開放最重要的肌肉,由位于舌下神經(jīng)運動核(hypoglossal motor nucleus, HMN)中的舌下神經(jīng)運動神經(jīng)元(hypoglossal motoneurons, HMs)發(fā)出的舌下神經(jīng)主干支配。HMs接受很多的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子支配,其中有一些的作用已經(jīng)完全探明,而且被證明對HMs的興奮性特別重要,但還有很多調(diào)節(jié)因子作用不明,因此,OSAHS的中樞調(diào)控機制還不明了,藥物治療也沒有獲得成功。在這其中,orexin和組胺是兩種非常重要的睡眠覺醒調(diào)節(jié)因子。Orexin,包括來自同一前體物質(zhì)prepro-orexin (PPO)的兩個單體orexin A和orexin B,主要通過與兩個G蛋白偶聯(lián)受體orexin受體1(OX1R)和orexin受體2(OX2R)發(fā)揮作用。大量研究證明,orexin在很多生理功能中發(fā)揮重要作用,例如飲食、能量代謝、情緒、壓力反應以及心血管功能等等。不僅如此,orexin還是大腦中最重要的促覺醒物質(zhì)之一,因此其可能與OSAHS患者夜間反復發(fā)生的覺醒有關(guān)。Orexin神經(jīng)元主要局限性的分布于外側(cè)下丘腦,但其神經(jīng)纖維卻廣泛的分布于全腦,對HMN中也有投射。而且OX1R和OX2R均在HMN中有表達。之前的研究表明,orexin可能與OSAHS密切相關(guān),但OSAHS對orexin系統(tǒng)的影響及orexin對OSAHS的調(diào)控作用均沒有得到明確的研究。與orexin一樣,組胺在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮眾多的生理功能,包括調(diào)節(jié)睡眠覺醒周期、能量和內(nèi)分泌代謝和運動控制等等。組胺能神經(jīng)元局限性的分布于結(jié)節(jié)乳頭核,但幾乎對全腦都有投射,包括延髓和HMN。組胺在大腦中有三種受體,組胺受體1(H1R)、組胺受體2(H2R)和組胺受體3(H3R),其中H1R在HMN中被發(fā)現(xiàn)有大量的表達。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),在HMN中微注射組胺能增加頦舌肌的張力,但目前還沒有一個研究探明組胺對HMs的調(diào)控作用及其機制的研究。[目的]探明CIH對orexin的影響及其orexin和組胺對HMs的調(diào)控作用,不僅有利于完善OSAHS的中樞調(diào)控機制,而且有利于尋找OSAHS治療的新靶點,為未來OSAHS的藥物治療提供基礎(chǔ)。因此,本研究旨在通過間歇低氧艙和膜片鉗技術(shù),深入研究：(1)CIH對大腦orexin系統(tǒng)的影響,從而探明orexin在OSAHS患者夜間覺醒中所扮演的作用；(2)Orexin對HMs興奮性的調(diào)控作用和具體機制,從而探明orexin反向?qū)SAHS的調(diào)節(jié)作用；(3)探明組胺對HMs興奮性的調(diào)控作用和具體機制,完善OSAHS的中樞調(diào)控機制。首先,本研究第一部分采用間歇低氧和膜片鉗電流鉗的方法,研究orexin和OSAHS相互影響。本研究的第二部分將結(jié)合電壓鉗和電流鉗的方法,深入研究組胺對HMs的調(diào)控作用,及其受體機制、信號傳導過程和離子機制。[方法]1.采用自制的CIH動物艙,通過控制艙內(nèi)氧氣和氮氣的流量,使得每一次缺氧循環(huán)時間為lmin,氧氣濃度循環(huán)于6%-21%之間,將40只大鼠隨機分為5組,每組8只,分別為IH 1周組、IH 5周組、復氧組和兩個對照組,將IH組置于動物艙給予間歇低氧,每天8小時,每周7天。復氧組前35天處理同CIH組,第36天起艙內(nèi)輸入空氣,每天8小時,持續(xù)5周。兩個對照組均輸入空氣,其余條件與IH組相同,分別持續(xù)1周和5周(IA1周和IA5周組)。實時熒光定量PCR (Real-time PCR, RT-PCR)監(jiān)測大腦下丘腦PPO、下丘腦和延髓OX1R和OX2R mRNA的表達水平。2.采用國際通氣的膜片鉗技術(shù),將出生約6-10天的大鼠幼崽HMN切成含成活HMs的急性腦片,通過電流鉗記錄和分析系統(tǒng)研究orexin A對HMs發(fā)放速率和膜電位的影響,及其OX1R和OX2R受體拮抗劑對orexin A效應的影響。3.采用膜片鉗技術(shù)中的電流鉗和電壓鉗技術(shù),將出生約10-16天的大鼠幼崽的HMN切成含成活HMs的急性腦片,記錄和分析組胺對HMs的調(diào)控作用,及其受體機制、信號傳導過程和離子機制。[結(jié)果]1.CIH上調(diào)下丘腦PPO的表達水平,復氧能有效逆轉(zhuǎn)這種上調(diào)RT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,間歇低氧1周能顯著降低下丘腦PPOmRNA的表達水平(相對分光度為0.49±0.11 vs.1.00±0.15,P0.05)。與1周不同,間歇低氧5周后下丘腦PPO mRNA的水平達到對照組的2.1倍(P0.05)。8只經(jīng)過5周CIH的大鼠再經(jīng)5周復氧后,PPO mRNA的表達水平與5周對照組沒有明顯的差異(相對分光度為1.32±0.09 vs.1.00±0.12,P0.05)。然而,復氧組與CIH組相比差異明顯(P0.05)。2.CIH增加下丘腦和延髓orexin受體的表達下丘腦是覺醒控制的重要區(qū)域,而延髓是HMN的所在地,與OSAHS密切相關(guān)。RT-PCR結(jié)果顯示,1周的IH不能改變下丘腦和延髓OX1R mRNA的表達,但是與1周對照組相比,其明顯增加延髓OX2R的表達。當IH時間增長到5周時,下丘腦和延髓中的OX1R和OX2R都出現(xiàn)明顯的上升。其中,OX2R在延髓的平均表達水平達到對照的4.5倍,OX1R在延髓的平均表達水平也達到2.41倍。5周的復氧后,下丘腦OX1R和OX2R mRNA水平上升明顯得到逆轉(zhuǎn),與IA5周組無明顯差異。復氧后延髓OX2R的表達水平依然高于對照的IA 5周組(P0.05),但也明顯低于CIH組(P0.05)。3. Orexin A增加HMs的發(fā)放速率并使其膜去極化全細胞膜片鉗記錄顯示,胞外灌流液中加入orexin A (4-500 nM),能顯著的增加HMs的發(fā)放速率并使HMs膜去極化。這種興奮效應具有劑量依賴性,4nM、 20nM、100nM和500 nM的orexin A分別使HMs的發(fā)放速率增加108.75%±0.42%(P0.05,與control對比,n=7)、148.45±6.01%(P0.05,n=13),203.95±9.18(P0.05,n=16)和310.91±18.19%(P0.05,n=9)；4nM、20nM、100nM和500 nM的orexin A分別使HMs的膜電位去極化1.00±0.13 mV(n=7)、3.98±0.46 mV(n=13)、7.27±0.72 mV(n=16)和16.72±1.49 mV(n=9)。4.OX1R和OX2R共同介導orexin A對HMs的興奮作用胞外灌流液中預先加入TTX(1μM)并不能拮抗orexin A的去極化作用,說明orexin A的作用是直接的突觸后膜效應。胞外液預先加入orexin 1受體拮抗劑SB 334867(10 μM), orexin A (100 nM)引起的發(fā)放增加明顯減弱(174.08±4.72%vs.203.95±9.18%,P0.05,n=7)。同樣,預先加入orexin 2受體拮抗劑TCS OX229(10 μM)后, orexin A (100 nM)引起的發(fā)放增加作用也明顯減弱(136.43±3.83 vs.203.95±9.18%,P0.05,n=7)。不僅如此,兩個拮抗劑均能分別拮抗orexin A的去極化作用。當SB 334867和TCS OX229合用時,oreixn A不僅不能增加HMs的發(fā)放速率,而且不能引起膜去極化。說明OX1R和OX2R共同介導了orexin A的作用。5.組胺引起內(nèi)向電流從而使HMs膜去極化,并且有脫敏作用電流鉗記錄顯示,胞外灌流液中加入組胺(3-100 μM)能引起HMs的膜去極化。這種去極化效應具有劑量依賴性,3μM、10 μM、30μM和100μM的組胺分別使HMs去極化1.13±0.09 mV(n=9)、2.96±0.24mV(n=10)、7.26±0.33 mV(n=13)和12.29±1.10 mV(n=9)。但如果給同一個細胞或同一塊腦片灌流兩次組胺后發(fā)現(xiàn),第二次給藥引起的去極化較第一次減少(3.17±0.43 mV vs.7.60±0.35mV,P0.05,n=9),說明組胺的效應具有脫敏。電壓鉗顯示,組胺使HMs去極化的原因是產(chǎn)生了一個內(nèi)向電流。6.H1R介導了組胺對HMs的興奮作用TTX不能拮抗組胺的去極化作用,TTX、bicuculline、APV和CNQX共同作用不能拮抗組胺產(chǎn)生的內(nèi)向電流,說明組胺的效應是一種直接的突觸后膜效應。在組胺H1受體拮抗劑pyrilamine (30μM)存在的情況下,組胺(30 μM)并不能使HMs的膜去極化。但在H2受體拮抗劑cimetidine (30μM)存在的情況下,組胺(30μM)依舊能使HM去極化(7.10±0.22 mV, n=7 vs.7.26±0.33 mV, P0.05)。H1受體的特異性激動劑2-(2-吡啶基)乙胺(2-pyridylethylamine,2-PyEA)能很好的模仿組胺的作用,但H2受體的特異性激動劑dimaprit和組胺H3受體的特異性激動劑r-α-methylhistamine均沒有明顯作用。說明只有組胺H1受體介導了組胺的作用。7.組胺效應的具體信號傳導過程在ACSF中預先加入PKA和PKC的抑制劑H-89(10μM)和chelerythrine(10 μM),2-PyEA依然產(chǎn)生明顯的內(nèi)向電流(P0.05)。但預先加入PLC-IP3抑制劑U-73122(10 μM)后,2-PyEA并不能引起內(nèi)向電流,說明組胺作用的信號通路為H1R/G9/11/PLC/IP3/Ca2+,PKA和PKC在其中沒有作用.8.組胺的作用依賴于膜內(nèi)鈣離子和膜外鈉離子鉀離子通道的廣譜拮抗劑Ba2+(4 mM BaCl2)并不能拮抗2-PyEA的作用(p0.05),HCN的拮抗劑ZD 7288(50μM)也不能拮抗2-PyEA的作用。但在Tris-ACSF或無鈣電極內(nèi)液中,2-PyEA(30μM)引起的內(nèi)向電流明顯減少(P0.05),分別為8.11±4.38 pA(n=7)和36.93±5.49 pA(n=6)。說明組胺和2-PyEA的作用不依賴鉀離子和HCN離子通道,只依賴于胞外鈉離子和胞內(nèi)鈣離子濃度,可能通過鈉鈣交換體的作用引起內(nèi)向電流并最終導致膜去極化。[結(jié)論]CIH能不僅能顯著增高下丘腦orexin前體的表達,并且能明顯增加下丘腦和延髓orexin受體的表達水平；反之,orexin可以通過OX1R和OX2R調(diào)節(jié)HMs的興奮性,因此可以推測orexin在OSAHS的睡眠片段化和OSAHS的病理生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。組胺也可調(diào)節(jié)HMs的興奮性從而在OSAHS的中樞調(diào)控中發(fā)揮作用,其具體信號通路為Gq/11/PLC/IP3/Ca2+傳遞信號,最終可能激活鈉鈣交換體,引起內(nèi)向電流,使HMs膜去極化。Orexin和組胺的研究致力于完善OSAHS的中樞調(diào)控機制,希望為OSAHS的藥物研究建立一定的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：阻塞性睡眠呼吸暫停通氣綜合征 慢性間歇低氧 發(fā)病機制 藥物治療 Orexin A OX_1R OX_2R 組胺 2-PyEA 信號通路 離子機制
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R766
【目錄】：

• 中英文縮寫一覽表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 第一部分16-42
• 前言16-18
• 材料18-20
• 方法20-25
• 實驗結(jié)果25-35
• 討論35-37
• 生理意義37-38
• 參考文獻38-42
• 第二部分42-68
• 前言42-44
• 材料與方法44-48
• 實驗結(jié)果48-59
• 討論59-62
• 研究意義62-64
• 參考文獻64-68
• 文獻綜述68-78
• 參考文獻75-78
• 在學期間發(fā)表和待發(fā)表的文章78-79
• 致謝79-80

【共引文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李博;五步蛇毒致大鼠海馬組胺受體基因表達變化與學習記憶功能障礙的關(guān)系研究[D];重慶師范大學;2006年

2 徐宇;非咪唑類H_3受體拮抗劑的設計、合成及活性研究[D];浙江大學;2008年

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本文編號：719894