本文關(guān)鍵詞：EB病毒Zta-P54蛋白在大腸桿菌中的表達、純化及檢測方法的初步探索

  更多相關(guān)文章： EB病毒 鼻咽癌 Zta-P54融合蛋白 原核表達 蛋白純化 ELISA檢測

【摘要】：EB病毒與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)，該病毒以環(huán)狀DNA的形式整合在宿主細胞染色體上。由于鼻咽位置較深，早期病變在臨床常規(guī)體檢中不容易被發(fā)現(xiàn)，且CT等影像學(xué)診斷很難區(qū)分早期鼻咽癌與其它鼻咽增生性病變。因此，創(chuàng)傷小、成本低、檢測速度快的血清學(xué)診斷方法是目前鼻咽癌早期診斷研究的熱點和難點。鑒于此我們擬通過表達鼻咽癌BZLF1-BMRF1融合基因的蛋白抗原來建立檢測病人血清中EB病毒相關(guān)抗體，為鼻咽癌的早期診斷及廣譜篩查提供技術(shù)手段。 本研究根據(jù)本實驗室pGEX5T-BZLF1-BMRF1質(zhì)粒的測序結(jié)果，利用premer5.0設(shè)計引物，從已有EB病毒抗原基因序列的質(zhì)粒上，通過PCR方法擴增獲得目的基因片段，與載體pET32a連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a/BZLF1-BMRF1，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析蛋白可溶性、Western blot檢測所表達蛋白的免疫原性，并通過優(yōu)化的硫酸銨沉淀、離子交換層析和親和層析對重組蛋白進行純化。辣根過氧化物酶標記純化的Zta-P54融合蛋白，利用棋盤法確定重組抗原包被和酶標抗體工作濃度，初步建立新的鼻咽癌診斷及篩查ELISA方法，對其進行特異性、精密性和臨床分析。結(jié)果表明：1）成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a/BZLF1-BMRF1實現(xiàn)了Zta-P54融合蛋白的可溶性表達；2）建立了該抗原的優(yōu)化純化程序，純度可達96.5%；3）利用所表達蛋白初步建立了鼻咽癌ELISA間接檢測方法與臨床診斷結(jié)果符合率較高，有望用于鼻咽癌前期輔助診斷及大規(guī)模篩查，同時，為鼻咽癌特異性血清學(xué)診斷方法的建立提供了借鑒。
【關(guān)鍵詞】：EB病毒 鼻咽癌 Zta-P54融合蛋白 原核表達 蛋白純化 ELISA檢測
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63;Q78
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 符號說明10-12
• 1 文獻綜述12-22
• 1.1 課題背景12
• 1.2 形態(tài)學(xué)特點及分子結(jié)構(gòu)12-14
• 1.2.1 形態(tài)學(xué)特點12-13
• 1.2.2 EB 病毒的分子結(jié)構(gòu)13-14
• 1.3 EB 病毒的感染與增殖14
• 1.4 EB 病毒基因組的轉(zhuǎn)錄與表達14-16
• 1.4.1 BZLF1 基因和其表達蛋白15-16
• 1.4.2 BHRF1 與 BALF1 基因16
• 1.5 EB 病毒與相關(guān)疾病16-19
• 1.5.1 腫瘤性疾病17
• 1.5.2 慢性活動性 EB 病毒感染（CAEBV）17
• 1.5.3 EB 病毒與鼻咽癌的發(fā)生17-19
• 1.5.4 EB 病毒與其他相關(guān)疾病19
• 1.6 檢測的方法19-21
• 1.6.1 直接檢測 EBV 基因組或其表達產(chǎn)物19-20
• 1.6.2 EBV 血清學(xué)檢查20
• 1.6.3 EB 病毒分子生物學(xué)診斷方法20-21
• 1.7 本課題的目的和意義21
• 1.8 本課題的創(chuàng)新點21-22
• 2 材料和方法22-51
• 2.1 實驗材料22-35
• 2.1.1 載體與受體菌22-23
• 2.1.2 血清23
• 2.1.3 主要儀器與設(shè)備23-24
• 2.1.4 主要試劑24-25
• 2.1.5 主要溶液的配制25-35
• 2.2 方法35-51
• 2.2.1 Zta-P54 融合抗原的克隆與鑒定35-39
• 2.2.2 重組蛋白抗原片段的表達、純化、鑒定39-46
• 2.2.3 間接 ELISA 方法的初步建立46-51
• 3 實驗結(jié)果與分析51-65
• 3.1 EBV 基因的擴增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建51-52
• 3.1.1 PCR 擴增目的基因片段51
• 3.1.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定51-52
• 3.1.3 測序鑒定52
• 3.2. 重組蛋白的誘導(dǎo)表達、純化、鑒定52-60
• 3.2.1 初步誘導(dǎo)表達優(yōu)化52-54
• 3.2.2 重組蛋白的 Western Blot 鑒定54-55
• 3.2.3 重組菌誘導(dǎo)條件的優(yōu)化55-57
• 3.2.4 蛋白的大樣誘導(dǎo)及純化57-59
• 3.2.5 重組蛋白 Zta-P54 濃度的測定59-60
• 3.3 間接法的初步建立60-65
• 3.3.1 質(zhì)控品建立60
• 3.3.2 包被條件的優(yōu)化60-63
• 3.3.4 反應(yīng)時間的確定63
• 3.3.5 樣本加樣量確定63-64
• 3.3.6 血清標本檢測64
• 3.3.7 板內(nèi)精密性試驗64-65
• 4 討論65-68
• 4.1 目的基因片段的選擇65
• 4.2 表達載體選擇和表達條件的優(yōu)化65-66
• 4.3 重組抗原純化方法的選擇66
• 4.4 基因工程抗原的優(yōu)勢66-67
• 4.5 ELISA 檢測方法的選擇67
• 4.6 未來的工作67-68
• 5 結(jié)論68-69
• 參考文獻69-74
• 致謝74-75
• 附錄75-79
• 個人簡歷79

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：718961