本文關(guān)鍵詞：干細(xì)胞源性視泡樣結(jié)構(gòu)電鏡觀察及組織工程化視網(wǎng)膜構(gòu)建初探

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【摘要】：視網(wǎng)膜退行性疾病,如老年性黃斑變性和色素性視網(wǎng)膜炎等,主要累及感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,導(dǎo)致感光細(xì)胞退行性變,最終造成患者的失明,但尚無有效治療方法。業(yè)已開展的基因治療和抗血管生成治療等研究,僅能延緩病情的發(fā)展。然而,近年來開展的細(xì)胞替代治療研究為這些疾病的治療帶來了希望,人們正在嘗試不同種類細(xì)胞的移植,包括胚胎干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等,以期實現(xiàn)病變視網(wǎng)膜再生的目的。但細(xì)胞移植治療存在諸多問題,包括移植細(xì)胞的存活率低、難與宿主細(xì)胞整合等。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展,人們開始考慮用組織工程的方法來促進移植細(xì)胞的存活、分化及與宿主視網(wǎng)膜的整合。本課題以構(gòu)建組織工程化視網(wǎng)膜為目的,從人胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化入手,對體外形成的視泡樣結(jié)構(gòu)的超微結(jié)構(gòu)特點進行比較分析、構(gòu)建不同類型PLGA支架,并觀察視網(wǎng)膜前體細(xì)胞在支架上的生長情況,為組織工程化視網(wǎng)膜的構(gòu)建提供參考依據(jù)。實驗采用改良的培養(yǎng)方案,將人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成早期視泡或視杯樣結(jié)構(gòu),分化出視網(wǎng)膜細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,并嘗試通過改變培養(yǎng)液的成分,實現(xiàn)視網(wǎng)膜細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化。通過免疫熒光方法來鑒定誘導(dǎo)分化的細(xì)胞類型；進一步通過透射電鏡對視泡或視杯樣結(jié)構(gòu)進行觀察,以了解其內(nèi)部細(xì)胞分裂分化情況。以PLGA為材料,通過溶劑鑄造方法,制造得到PLGA支架。將誘導(dǎo)分化得到的視網(wǎng)膜細(xì)胞作為種子細(xì)胞種植到PLGA支架上構(gòu)建出“視網(wǎng)膜細(xì)胞-支架”復(fù)合物,觀察細(xì)胞生長發(fā)育的情況,對種子細(xì)胞的類型、支架的材料和結(jié)構(gòu)進行分析。體外培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞,進行誘導(dǎo)分化至7周,可以觀察到人胚胎干細(xì)胞克隆邊緣光滑,色澤光亮；克隆內(nèi)細(xì)胞核質(zhì)比高,分布均勻。而已經(jīng)分化的克隆形狀扁平,中央部位色澤加深,克隆內(nèi)核質(zhì)比降低。誘導(dǎo)分化的細(xì)胞經(jīng)歷EB球、rosette樣結(jié)構(gòu)、視泡或視杯樣結(jié)構(gòu),可分為無色素、有色素等類型。免疫熒光結(jié)果顯示,人胚胎干細(xì)胞被成功誘導(dǎo)分化為Chx10+的神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞球、Mitf+的色素視網(wǎng)膜細(xì)胞球和混合細(xì)胞球。透射電鏡觀察了來源于不同品系干細(xì)胞誘導(dǎo)分化至7.5周至13周的細(xì)胞球。發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞中央有空腔或裂隙,類似眼胚胎發(fā)育時期的視泡或視杯樣結(jié)構(gòu),并在近腔側(cè)球壁可見少數(shù)正在分裂中的細(xì)胞,還可見少量處于凋亡中的細(xì)胞,與在體神經(jīng)上皮細(xì)胞發(fā)育模式相近。分化早期,球壁細(xì)胞有多層,細(xì)胞排列較密集,但細(xì)胞間可見縫隙；細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則形,核仁明顯,可見分散的異染色質(zhì)；細(xì)胞有短的突起,細(xì)胞質(zhì)較少。分化晚期細(xì)胞球,部分球壁仍有多層細(xì)胞,細(xì)胞形狀多樣,近腔側(cè)細(xì)胞呈長柱狀,偶見伸入腔面的纖毛樣結(jié)構(gòu)或膜盤樣結(jié)構(gòu),提示為分化中的感光細(xì)胞；細(xì)胞出現(xiàn)明顯分化,細(xì)胞質(zhì)增多,含有較多粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器；細(xì)胞突起多而長,有些細(xì)胞間可見細(xì)胞連接樣結(jié)構(gòu),部分突起中可見突觸囊泡樣結(jié)構(gòu)。部分球壁變得很薄,與厚壁部分分界清晰,僅由單層立方或扁平細(xì)胞構(gòu)成,細(xì)胞之間排列緊密,細(xì)胞之間可見連接結(jié)構(gòu)；細(xì)胞核變扁平,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有非常豐富的細(xì)胞器,近腔側(cè)可見較多的黑素顆粒,顆粒大小不一,染色深淺不一,呈圓形或橢圓形,大多由呈同心圓排列的板層狀結(jié)構(gòu),提示為不同發(fā)育階段的黑素顆粒；細(xì)胞游離面有密集排列的微絨毛樣結(jié)構(gòu)。通過溶劑鑄造方法得到了兩種不同孔結(jié)構(gòu)的PLGA支架,即取向型支架和非取向型支架。掃描電鏡顯示支架的最大孔徑在100μm左右,孔徑之間有25μm左右的孔徑相通。我們將支架切割成厚約1mm,大小在5×5mm左右的薄片,將誘導(dǎo)分化至7周的人胚干細(xì)胞種植在支架上,每個支架上細(xì)胞數(shù)量在1×106。將“視網(wǎng)膜細(xì)胞-支架”復(fù)合物聯(lián)合培養(yǎng)兩天,掃描電鏡觀察顯示,在取向型支架上幾乎見不到細(xì)胞生長,而在非取向支架上細(xì)胞密度大,生長狀態(tài)良好,且伸出許多突起,彼此間建立了廣泛的連接。這可能與取向支架孔隙大且貫穿支架兩面,種植細(xì)胞大量漏出有關(guān),而非取向支架孔隙雖大,但半球形狀使其可以裝載更多細(xì)胞且不存在細(xì)胞大量漏出的情況。我們還可以看到細(xì)胞在非取向支架上的分布有兩種情況。一種類似視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,呈片狀分布；另一種形成細(xì)胞團。這可能與種子細(xì)胞中包含不同種類視網(wǎng)膜細(xì)胞有關(guān)。我們現(xiàn)有的誘導(dǎo)方案可以成功得到神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞球和色素視網(wǎng)膜細(xì)胞球,且誘導(dǎo)分化的細(xì)胞可以形成色素顆粒、膜盤等具有視網(wǎng)膜細(xì)胞特征的超微結(jié)構(gòu),提示這些細(xì)胞正在朝向特定的視網(wǎng)膜細(xì)胞分化,可用于構(gòu)建組織工程化視網(wǎng)膜。通過溶劑鑄造技術(shù)得到的PLGA支架,具有一定的生物相容性。以1×106的數(shù)量將細(xì)胞種在大小5×5mm、厚約1mm的PLGA支架上后,可觀察到細(xì)胞生長狀態(tài)良好,有兩種分布狀態(tài),能建立廣泛的聯(lián)系。非取向型支架由于能裝載更多細(xì)胞而優(yōu)于取向型支架。
【關(guān)鍵詞】：人胚胎干細(xì)胞 視網(wǎng)膜 支架 組織工程
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R774
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 第一章 人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞10-21
• 1 前言10-11
• 2 材料和方法11-14
• 3 結(jié)果14-16
• 4 討論16-17
• 5 小結(jié)17
• 參考文獻(xiàn)17-21
• 第二章 體外誘導(dǎo)形成視泡樣結(jié)構(gòu)的超微結(jié)構(gòu)21-35
• 1 前言21
• 2 材料和方法21-24
• 3 結(jié)果24-29
• 4 討論29-31
• 5 小結(jié)31-32
• 參考文獻(xiàn)32-35
• 第三章 組織工程視網(wǎng)膜用支架構(gòu)建35-47
• 1 前言35-37
• 2 材科和方法37-38
• 3 結(jié)果38-42
• 4 討論42-44
• 5 小結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-47
• 第四章 視網(wǎng)膜前體細(xì)胞在支架上生長的初步觀察47-56
• 1 前言47-48
• 2 材料和方法48-49
• 3 結(jié)果49-51
• 4 討論51-52
• 5 小結(jié)52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 綜述56-67
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 附錄67-68
• 致謝68-70

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 萬瑾;鄭華;俞亦齡;佘振玨;肖虹蕾;周國民;;視網(wǎng)膜祖細(xì)胞干細(xì)胞特性及移植入視網(wǎng)膜后的研究[J];解剖學(xué)雜志;2006年01期

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本文編號：713481