本文關(guān)鍵詞：抑制FGF信號(hào)通路對(duì)橢圓囊毛細(xì)胞再生的調(diào)控研究

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【摘要】：目的慶大霉素等氨基糖苷類(lèi)藥物對(duì)內(nèi)耳的毒性作用可通過(guò)破壞毛細(xì)胞而引起的聽(tīng)力和平衡功能受損表現(xiàn)出來(lái)。但慶大霉素對(duì)橢圓囊感覺(jué)上皮的破壞程度和抑制FGF信號(hào)通路對(duì)過(guò)表達(dá)Atoh1/Math1基因引起毛細(xì)胞再生的調(diào)控作用仍有待詳細(xì)論述。本研究擬解決問(wèn)題：1.利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)慶大霉素處理小鼠橢圓囊不同時(shí)間段引起的微紋區(qū)和非微紋區(qū)毛細(xì)胞損傷程度和細(xì)胞增殖程度進(jìn)行研究；2.抑制FGF信號(hào)通路對(duì)Ad-Math1誘導(dǎo)小鼠橢圓囊感覺(jué)上皮區(qū)域與非感覺(jué)上皮區(qū)域內(nèi)細(xì)胞增殖和毛細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生的調(diào)控作用；3. Ad-Math1誘導(dǎo)產(chǎn)生的新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞是否具有細(xì)胞平面極性及其調(diào)控機(jī)制研究。 方法本研究使用慶大霉素建立體外培養(yǎng)橢圓囊毛細(xì)胞的損傷模型。于不同時(shí)間段觀察慶大霉素對(duì)橢圓囊微紋區(qū)和非微紋區(qū)內(nèi)Phalloidin標(biāo)記的毛細(xì)胞纖毛和毛細(xì)胞特異性抗體MyosinⅦa陽(yáng)性細(xì)胞的破壞程度；以及通過(guò)增殖細(xì)胞EdU特異性染色觀察感覺(jué)上皮和非感覺(jué)上皮的細(xì)胞增殖情況。之后,利用激光共聚焦和SPSS軟件從形態(tài)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)角度驗(yàn)證和分析慶大霉素對(duì)毛細(xì)胞的破壞和細(xì)胞增殖的作用。通過(guò)含有Atoh1/Mathl基因的腺病毒載體(Ad-Math1)轉(zhuǎn)染小鼠體外培養(yǎng)橢圓囊組織以促進(jìn)毛細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生。對(duì)轉(zhuǎn)病毒后不同時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本進(jìn)行固定和免疫組織化學(xué)染色,驗(yàn)證過(guò)表達(dá)Atohl/Math1基因?qū)Ω杏X(jué)上皮和非感覺(jué)上皮細(xì)胞增殖情況、新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)量和規(guī)律的影響。與此同時(shí),FGF信號(hào)通路阻滯劑與加入Ad-Math1和／或慶大霉素的橢圓囊組織共培養(yǎng),觀察其對(duì)新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞的調(diào)控作用。最后應(yīng)用觀察細(xì)胞平面極性的抗體Spectrin、γ-tubulin對(duì)Ad-Math1轉(zhuǎn)染的橢圓囊標(biāo)本進(jìn)行免疫熒光染色,觀察新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞平面極性規(guī)律。 結(jié)果通過(guò)免疫熒光染色的形態(tài)學(xué)和SPSS的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究表明,體外培養(yǎng)新生小鼠前庭橢圓囊在慶大霉素處理后最早出現(xiàn)毛細(xì)胞纖毛損傷,以微紋區(qū)較明顯；毛細(xì)胞特異性標(biāo)記物MyosinⅦa陽(yáng)性的細(xì)胞隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少；標(biāo)記毛細(xì)胞前體細(xì)胞的Sox2陽(yáng)性細(xì)胞在微紋區(qū)中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增多。同時(shí),橢圓囊感覺(jué)上皮區(qū)域在慶大霉素處理后增殖細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多,但隨著用藥劑量的增加,增殖細(xì)胞逐漸減少。Ad-Math1和慶大霉素共同作用橢圓囊組織后,感覺(jué)上皮區(qū)域細(xì)胞增殖較單純加入慶大霉素或Ad-Math1組多,且主要位于微紋區(qū)。當(dāng)同時(shí)加入FGF阻滯劑SU5402時(shí),增殖細(xì)胞無(wú)明顯增多,但感覺(jué)區(qū)域與非感覺(jué)區(qū)域毛細(xì)胞特異性標(biāo)記物MyosinⅦa陽(yáng)性細(xì)胞,即新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞較單純加入Ad-Math1組增多。新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞動(dòng)纖毛從細(xì)胞表面中央逐漸移向一側(cè),且標(biāo)記毛細(xì)胞纖毛極性的特異性標(biāo)記物Spectrin和γ-tubulin染色顯示感覺(jué)上皮區(qū)域新生的毛細(xì)胞樣細(xì)胞與原位存在的毛細(xì)胞平面極性方向一致,即纖毛延極性分界線相對(duì)排列。而非感覺(jué)上皮區(qū)域新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞極性紊亂。 結(jié)論慶大霉素處理體外培養(yǎng)小鼠橢圓囊可導(dǎo)致毛細(xì)胞的損傷,并伴有感覺(jué)上皮和非感覺(jué)上皮細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。當(dāng)過(guò)量表達(dá)Atoh1/Math1基因可促使橢圓囊感覺(jué)上皮和非感覺(jué)上皮區(qū)域細(xì)胞轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞樣細(xì)胞。抑制FGF信號(hào)通路可促進(jìn)Ad-Math1介導(dǎo)的橢圓囊組織新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)量增多,卻對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯調(diào)控作用。新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞纖毛形成規(guī)律類(lèi)似胚胎期纖毛形成規(guī)律,且感覺(jué)上皮區(qū)域新生的毛細(xì)胞樣細(xì)胞與原位存在的毛細(xì)胞平面極性方向一致,而非感覺(jué)上皮區(qū)域新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞無(wú)統(tǒng)一極性。
【關(guān)鍵詞】：橢圓囊 Atoh1/Math1基因 FGF信號(hào)通路 毛細(xì)胞 毛細(xì)胞再生 慶大霉素 細(xì)胞增殖 平面細(xì)胞極性(PCP) 纖毛
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R764
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-22
• References16-22
• 第一章 慶大霉素對(duì)橢圓囊毛細(xì)胞損傷模型的建立22-42
• 前言22-25
• References23-25
• 材料方法25-30
• 結(jié)果與附圖30-37
• 結(jié)論37-38
• 討論38-40
• References40-42
• 第二章 抑制FGF信號(hào)通路對(duì)Ad-Math1介導(dǎo)橢圓囊毛細(xì)胞再生數(shù)量的調(diào)控42-65
• 前言42-45
• References44-45
• 材料方法45-49
• 結(jié)果與附圖49-61
• 結(jié)果61-62
• 討論62-64
• References64-65
• 第三章 橢圓囊再生毛細(xì)胞極性的特點(diǎn)65-79
• 前言65-67
• Reference66-67
• 材料與方法67-71
• 結(jié)果與附圖71-76
• 結(jié)果76-77
• 討論77-78
• References78-79
• 全文小結(jié)79-80
• 本文創(chuàng)新性80-81
• 致謝81-82
• 已發(fā)表和在投文章82-83

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