本文關(guān)鍵詞：CDK4基因在鼻咽癌中的功能和分子機(jī)制的初步研究

  更多相關(guān)文章： CDK4 鼻咽癌 miRNA 細(xì)胞周期

【摘要】：研究背景與目的鼻咽癌是中國(guó)南方和東南亞地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一,具有明顯的區(qū)域 分布特征。在臨床上,鼻咽癌是具有特殊流行病學(xué)、臨床特點(diǎn)、病理組織學(xué)特 點(diǎn)的頭頸部惡性腫瘤。鼻咽癌的發(fā)生可能與基因易感性、環(huán)境危險(xiǎn)因素、特定 飲食習(xí)慣和EB病毒感染及突變等因素有關(guān)。鼻咽癌的生成涉及多個(gè)基因和多 條信號(hào)通路改變,如Akt、細(xì)胞周期、Wnt通路及表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路等, 這些都促進(jìn)了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。因此,鼻咽癌相關(guān)重要基因及其介導(dǎo)的信號(hào) 通路研究將有助于進(jìn)一步揭示鼻咽癌的發(fā)病機(jī)理。我課題組主要參與利用多組含8000個(gè)基因的microarray比較了鼻咽癌組織 (鼻咽癌細(xì)胞含量占整個(gè)組織的70%以上)、混合的鼻咽癌細(xì)胞與鼻咽上皮組 織之間的基因表達(dá)譜。通過(guò)BRB軟件分析,一共獲得了435個(gè)上調(diào)基因和257 個(gè)下調(diào)基因。進(jìn)一步,我們對(duì)這些差異表達(dá)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了分析, 觀察到了細(xì)胞周期信號(hào)通路在鼻咽癌中出現(xiàn)了明顯的異常,這其中就涉及了細(xì) 胞周期依賴性激酶4(CDK4)的表達(dá)異常。CDK4是絲氨酸／蘇氨酸激酶家族的成員,主要在腫瘤細(xì)胞核中表達(dá),但并 非是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。其常與周期蛋白D(cyclin D)結(jié)合形成復(fù)合物,通過(guò)調(diào)控RB 基因磷酸化水平的丟失,上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子E2F1基因表達(dá),從而參與細(xì)胞周期G1 向S期轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié),并導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。已有研究表明,相比于瘤基因CCND1, CDK4基因在小鼠惡性皮膚瘤發(fā)病過(guò)程中展示了更高的致瘤活性。此外,CDK4已經(jīng)顯示在多種腫瘤中高表達(dá),這其中就包括了口腔鱗狀細(xì)胞、胰腺癌和肺癌等。而在鼻咽癌中,我們也發(fā)現(xiàn)了CDK4異常的高表達(dá)。以上研究提示了CDK4在起始腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。 microRNA (miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)源性的,長(zhǎng)度約為20-23個(gè)核苷酸的非編碼小RNA,能通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)而在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控,導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制。很多證據(jù)直接表明,miRNA通過(guò)調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá),參與腫瘤細(xì)胞的游走、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。如：過(guò)表達(dá)的MicroRNA-21能直接靶擊下調(diào)MARCKS、PDCD4和PTEN蛋白表達(dá)從而影響前列腺癌、人膠質(zhì)瘤、大腸癌和肝癌的游走、侵襲和轉(zhuǎn)移。過(guò)表達(dá)的miR-182通過(guò)直接抑制小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子M和FOXO3蛋白表達(dá)促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的游走和存活。CDK4在鼻咽癌中調(diào)控哪些miRNA表達(dá)?這些miRNA是對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生物學(xué)行為有何影響呢?而這些miRNA又在鼻咽癌中是否反過(guò)來(lái)調(diào)控CDK4介導(dǎo)的細(xì)胞周期信號(hào)通路?這些都是值得我們深入研究的問題。 基于CDK4在鼻咽癌中的研究現(xiàn)狀,本課題的研究目的為明確CDK4基因在鼻咽癌中的功能,探討其與miRNA的關(guān)系及參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,為鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究提供新思路。 研究?jī)?nèi)容與方法 1.CDK4基因在鼻咽癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平檢測(cè)：包括免疫組化和熒光定量PCR檢測(cè)CDK4表達(dá)水平。 2.沉默CDK4基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究 (1)構(gòu)建靶向抑制CDK4的shRNA慢病毒干擾載體,利用MTT法、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期等觀察CDK4表達(dá)抑制后細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移能力、細(xì)胞周期的變化,進(jìn)一步確定CDK4基因在鼻咽癌細(xì)胞中的功能。 (2)Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK6、CCND1、P21及E2F1的表達(dá)。 3.干擾CDK4后進(jìn)行miRNA芯片表達(dá)譜分析及目標(biāo)miRNA的功能、機(jī)制驗(yàn)證 (1)應(yīng)用miRNAs表達(dá)譜芯片篩選干擾CDK4后差異表達(dá)miRNA,熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證這些miRNA。 (2)選取表達(dá)差異顯著的Let-7c做為下一步研究對(duì)象, 使用Let-7c mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,利用MTT法、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)及Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)等觀察Let-7c mimics/inhibitor在細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移及侵襲能力的變化,進(jìn)一步確定Let-7c在鼻咽癌細(xì)胞中的功能。 (3)利用siRNA靶向沉默E2F1,熒光定量PCR檢測(cè)Let-7c表達(dá)變化。 (4) western blot檢測(cè)Let-7c mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞后CDK4、CCND1、P15、 P16、P21及E2F1、c-myc表達(dá)的變化。 結(jié)果 1. CDK4基因在鼻咽癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平檢測(cè) 免疫組化結(jié)果顯示,CDK4在大部分鼻咽上皮組織中呈低表達(dá)在鼻咽癌組織中有不同程度的表達(dá),但以高表達(dá)為主,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=10.997,P0.001)。選取8例鼻咽癌組織和8例鼻咽上皮組織進(jìn)一步用熒光定量PCR驗(yàn)證CDK4表達(dá)情況,CDK4在鼻咽癌組織中的表達(dá)高于鼻咽上皮組織,結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.483,P=0.003)。熒光定量PCR顯示,CDK4在8種鼻咽癌細(xì)胞SUNE1、5-8F、6-10B、CNE2、CNE1、HNE1、C6661、HONE1中mRNA水平表達(dá)較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.745,P0.001),其中5-8F和6-10B表達(dá)最高,可作為下一步實(shí)驗(yàn)對(duì)象。 2.沉默CDK4基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響 建立慢病毒干擾載體和陰性對(duì)照載體,包裝慢病毒后感染5-8F細(xì)胞,由于感染效率達(dá)到90%以上,western blot檢測(cè)干擾后CDK4蛋白的表達(dá)明顯下降,可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性干擾多克隆命名為C1-6、D2-4,陰性對(duì)照多克隆為MOCK。 1)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,與空載對(duì)照細(xì)胞MOCK相比,干擾多克隆細(xì)胞C1-6、D2-4生長(zhǎng)速度明顯減慢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.163P0.001)。 2)Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn),細(xì)胞培養(yǎng)12h后C1-6、D2-4穿過(guò)聚碳酸酯膜的數(shù)量多于MOCK(F=38.629,P0.001)。提示干擾CDK4后,細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減弱。 3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,C1-6、D2-4,與空載細(xì)胞相比,前者在G1期比例增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.163,P=0.027),提示CDK4表達(dá)抑制組明顯出現(xiàn)了細(xì)胞由G1向S期的轉(zhuǎn)化障礙,細(xì)胞阻滯在G1期。 4)采用western blot檢測(cè)了干擾CDK4后細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK6、CCND1、P21及E2F1的表達(dá),結(jié)果顯示CCND1、CDK6、E2F1表達(dá)下調(diào),P21表達(dá)上調(diào)。 3.干擾CDK4后miRNA芯片表達(dá)譜分析及功能、機(jī)制驗(yàn)證 1)干擾CDK4后的miRNA表達(dá)譜芯片研究,并利用BRB軟件分析,最后共得到35個(gè)差異的miRNAs基因,差異的倍數(shù)變動(dòng)在1.95-19.25之間不等,而且這35個(gè)miRNAs基因都展示一致上調(diào)。熒光定量PCR顯示,Let-7c表達(dá)差異顯著,選取Let-7c做為下一步研究對(duì)象。 2)靶向沉默E2F1后Let-7c的表達(dá)明顯上調(diào)(5-8G：t=-36.565,P0.001；6-10B：t=-34.738,P0.001)。 3)使用Let-7c mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,與空載對(duì)照細(xì)胞mimics Ctr/inhibitor Ctr相比,Let-7c mimics組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢,Let-7c inhibitor組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mimics F=25.486, P=0.021, Inhibitor F=43.894,P0.001)。 4)Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn),細(xì)胞培養(yǎng)12h后以,對(duì)照組相比,L--7c mimics組細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的數(shù)量減少,Let-7c inhibitor組細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的數(shù)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mimics t=7.572,P0.001,Inhibitort=5.494,P0.001)。提示過(guò)表達(dá)Let-7c后,細(xì)胞遷移能力減弱,干擾Let-7c后,細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。 5)Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn),細(xì)胞培養(yǎng)12h后以,對(duì)照組相比,Let-7c mimics組細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的數(shù)量減少,Let-7c inhibitor組細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的數(shù)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mimics t=6.147, P＜0.001, Inhibitort=5.741,P0.001)。提示過(guò)表達(dá)Let-7c后,細(xì)胞侵襲能力減弱,干擾Let-7c表達(dá)后,細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。 6)采用western blot檢測(cè)Let-7c mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞周期基因CDK4、P15、P16、P21、及E2F1、c-myc表達(dá)的變化,結(jié)果顯示Let-7c mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,CDK4、E2F1、c-myc表達(dá)下調(diào),P15、P16、P21表達(dá)上調(diào),反之亦然。 結(jié)論 1.干擾CDK4后,鼻咽癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)能力顯著降低,提示CDK4在鼻咽癌中是一個(gè)腫瘤促進(jìn)相關(guān)基因。 2.干擾CDK4后可能抑制細(xì)胞周期信號(hào)通路,通過(guò)抑制CCND1、CDK6及上調(diào)P21的表達(dá)參與細(xì)胞周期的調(diào)控；CDK4通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子E2F1調(diào)節(jié)Let-7c的表達(dá)。 3.過(guò)表達(dá)Let-7c后,鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力顯著降低,提示Let-7c在鼻咽癌中發(fā)揮了抑瘤的功能。其可能通過(guò)p15/p16/CDK4/E2F1信號(hào)通路發(fā)揮其抑瘤功能。
【關(guān)鍵詞】：CDK4 鼻咽癌 miRNA 細(xì)胞周期
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 技術(shù)路線20-21
• 第一章 CDK4在鼻咽癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)特性鑒定21-31
• 一 材料與方法21-25
• 二 結(jié)果25-29
• 三 討論29-30
• 參考文獻(xiàn)30-31
• 第二章 沉默CDK4對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響31-43
• 一 材料和方法31-36
• 二 結(jié)果36-41
• 三 討論41-43
• 第三章 沉默CDK4基因后miRNA芯片表達(dá)譜分析及目標(biāo)miRNA的功能驗(yàn)證43-64
• 一 材料和方法43-52
• 二 結(jié)果52-59
• 三 討論59-61
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 全文小結(jié)64-66
• 中英文縮略詞66-67
• 致謝67-68

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李杰恩,周永,藍(lán)新海,譚頌華,唐安洲,王仁生,馮震博;鼻咽癌組織放療前后細(xì)胞增殖凋亡的變化[J];腫瘤;2001年05期

2 汪波,石靈春,譚敏,肖楚梅,周丹;細(xì)胞周期調(diào)控基因在鼻咽癌發(fā)生中的表達(dá)[J];解剖學(xué)研究;2001年03期

3 陳淑勤,黃培生,李一偉,高凌云,王鏞;尿激酶型纖溶酶原激活物在鼻咽癌的表達(dá)及臨床意義[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2002年01期

4 郜紅藝,吳秋良,張玉;鼻咽癌預(yù)后相關(guān)的病理學(xué)研究[J];廣東醫(yī)學(xué);2002年04期

5 周小軍 ,田道法;鼻咽癌高危人群病理特征研究進(jìn)展[J];廣西醫(yī)學(xué);2002年05期

6 陳斌,殷善開;鼻咽癌的病因和流行病學(xué)狀況[J];中國(guó)全科醫(yī)學(xué);2002年04期

7 賀智敏,王水良,袁建輝,陳主初;人細(xì)胞色素P450 2E1基因在胚胎鼻咽組織、鼻咽癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)[J];癌癥;2002年06期

8 張明,劉立思,程磊;熱休克蛋白60表達(dá)和一氧化氮在鼻咽癌中的意義[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年06期

9 王茂鑫;;鼻咽癌組織中凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)及其意義[J];福州總醫(yī)院學(xué)報(bào);2004年04期

10 黃文君,賴祥進(jìn);鼻咽癌相關(guān)候選基因的研究[J];實(shí)用癌癥雜志;2005年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 符生苗;梁茱;董玉英;;鼻咽癌的P_(16)基因表達(dá)分析[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展（下冊(cè)）[C];1999年

2 劉青;王雅棣;景尚華;王曉玲;程云杰;吳鳳鵬;;E-鈣粘蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)放射腫瘤治療學(xué)分會(huì)六屆二次暨中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤放療專業(yè)委員會(huì)二屆二次學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

3 邵建永;王海云;朱志華;孫炳宇;陳靜;杜子明;張家興;邵瓊;黃馬燕;符珈;廖定準(zhǔn);侯景輝;盧泰祥;葉偉民;Ingemar Ernberg;曾益新;;鼻咽癌分子分型研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)日程及論文匯編[C];2010年

4 王樹森;管忠震;向燕群;汪波;林桐榆;姜文奇;張力;張惠忠;侯景輝;;鼻咽癌組織中EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)分子的表達(dá)[A];第三屆中國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)教育論文集[C];2004年

5 陳顯釗;;鼻咽癌診治研究進(jìn)展[A];海南省第二屆腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2005年

6 林少民;唐啟信;;鼻咽癌家族腫瘤史115例調(diào)查分析[A];海南省第二屆腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2005年

7 邵世宏;姚運(yùn)紅;;鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞及其表面標(biāo)志物初步研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2006年

8 李菊蘭;蔡華成;梁傳余;韓偉;;生長(zhǎng)抑素Ⅱ型受體在鼻咽癌組織中的表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國(guó)耳鼻咽喉-頭頸外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（下）[C];2007年

9 項(xiàng)光早;;微血管密度與鼻咽癌生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系的研究[A];浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻咽喉科學(xué)分會(huì)成立60周年慶典暨2011年浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2011年

10 潘建基;;鼻咽癌臨床診治現(xiàn)狀和進(jìn)展[A];中國(guó)腫瘤內(nèi)科進(jìn)展 中國(guó)腫瘤醫(yī)師教育（2014）[C];2014年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 湯清波邋李奇 劉齡予;挑戰(zhàn)“鼻咽癌”的人[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2007年

2 本報(bào)記者　 盧育輝;崇尚“紅�！本�,喜歡“咖啡”會(huì)友[N];廣東科技報(bào);2006年

3 本報(bào)記者　 羅艾樺;挑戰(zhàn)“廣東癌”[N];人民日?qǐng)?bào);2006年

4 仁華南;“回國(guó)發(fā)展是一項(xiàng)明智的選擇”[N];人民日?qǐng)?bào)海外版;2006年

5 本報(bào)記者 謝明霞;從蛋白質(zhì)組學(xué)入手 探究鼻咽癌[N];健康報(bào);2011年

6 廣東省第二人民醫(yī)院 主任醫(yī)師 蔡長(zhǎng)青;病毒與某些癌癥[N];家庭醫(yī)生報(bào);2005年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周文;鼻咽癌染色體12p12-11區(qū)段擴(kuò)增基因的篩選及其功能研究[D];中南大學(xué);2010年

2 覃綱;免疫球蛋白M與鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2007年

3 鄭英;基于鼻咽癌潛在靶標(biāo)的活體光學(xué)成像與靶向治療研究[D];華中科技大學(xué);2012年

4 鄧鵬;鐵皮石斛抗鼻咽癌的作用研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2010年

5 俞艷萍;ABCG2在鼻咽癌中的表達(dá)及其在鼻咽癌化療中的作用[D];華中科技大學(xué);2010年

6 陳舒華;鼻咽癌高癌家系體質(zhì)證型的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2008年

7 何英;7個(gè)鼻咽癌相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性的篩查及其與鼻咽癌易感性的關(guān)聯(lián)分析[D];中國(guó)人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);2003年

8 王路;EBNA1在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

9 樓建軍;抑癌基因單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌遺傳易感性研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2012年

10 張e，

本文編號(hào)：660716