發(fā)布時(shí)間：2017-08-09 18:36

  本文關(guān)鍵詞：EBV特異性CTL的制備及其對(duì)EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)的研究

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【摘要】：EB病毒(Epstein-barr virus, EBV)屬于人類皰疹病毒γ家族,廣泛存在人群中,成人感染率達(dá)到90%以上,是第一個(gè)公認(rèn)的致腫瘤病毒。鼻咽癌和淋巴瘤是常見(jiàn)的惡性腫瘤,是EBV潛伏感染、環(huán)境和宿主基因遺傳等多種因素共同參與、相互作用而逐步形成的復(fù)雜性疾病,預(yù)后較差。幾乎所有的鼻咽癌細(xì)胞以及大多數(shù)的淋巴瘤細(xì)胞能夠檢測(cè)到EBV基因組的存在,并通過(guò)編碼表達(dá)潛伏膜蛋白(Latent membrane protein, LMP)1-LMP2參與疾病的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移,這使得這些病毒蛋白成為理想的腫瘤靶抗原,為進(jìn)行過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療提供了有利的條件。腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)是由抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cell, APC)攝取加工腫瘤特異性抗原肽,協(xié)同白介素(Interleukin)-2等細(xì)胞因子的作用,體外激活初始T淋巴細(xì)胞生成的。因LMP1、LMP2免疫原性較低,如何選擇合適的APC穩(wěn)定的制備數(shù)量充足、活性良好的CTL是對(duì)上述兩種EBV陽(yáng)性腫瘤進(jìn)行過(guò)繼性免疫治療的關(guān)鍵。目的 本研究擬選擇樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DC)以及EBV轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞生成的永生化淋巴母細(xì)胞系(Lymphoblastoid cell lines, LCLs)作為兩種APC,體外制備穩(wěn)定增殖的EBV特異性CTL,并通過(guò)多種方法檢測(cè)EBV-CTL對(duì)EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,為選擇合適的APC進(jìn)行下一步的臨床研究提供理論基礎(chǔ)。 方法 1.T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)：分離人外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),經(jīng)CD3、CD28單克隆抗體刺激后,在IL-2的作用下大量擴(kuò)增外周血T淋巴細(xì)胞。CCK-8檢測(cè)不同培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞增殖的影響,選擇合適的培養(yǎng)基用于細(xì)胞的培養(yǎng)。 2.DC細(xì)胞的制備：PBMC貼壁分離,在IL-4、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)等細(xì)胞因子作用下誘導(dǎo)生成DC細(xì)胞并通過(guò)負(fù)載LMPs混合多肽刺激DC成熟,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá)。 3.LCLs的構(gòu)建：制備EBV病毒上清,按比例混合完全培養(yǎng)基培養(yǎng)PBMC,誘導(dǎo)生成LCLs。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá),RT-PCR擴(kuò)增細(xì)胞基因組,了解細(xì)胞的生物學(xué)特征。 4.絲裂霉素滅活LCLs:CCK-8檢測(cè)不同濃度絲裂霉素滅活后LCLs增殖速度,繪制增殖曲線,選擇滅活程度徹底、損傷小的濃度作為合適的滅活條件。 5.EBV-CTL的生物學(xué)活性研究：負(fù)載抗原的DC及滅活后LCLs作為APC體外誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞生成EBV-CTL,通過(guò)CCK-8、流式細(xì)胞儀、ELISA等方法對(duì)EBV-CTL體外殺傷腫瘤細(xì)胞、分泌IFN-γ的能力進(jìn)行分析判斷。結(jié)果 1.對(duì)四種培養(yǎng)條件下T淋巴細(xì)胞增殖情況進(jìn)行分析：1640+10%FBS與GT-T551+2%自身血漿兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖在第9天達(dá)到80倍。 2.制備的DC形態(tài)不規(guī)則,邊緣有明顯的毛刺狀突起。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子CD83、CD86的表達(dá)有明顯提高,表達(dá)量分別為42.07%及45.09%。 3.成功構(gòu)建LCLs,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面高度表達(dá)CD40、CD19、CD80、CD86分子,表達(dá)量分別為97.23%、90.06%、85.97%、50.41%；RT-PCR成功擴(kuò)增LMP1、LMP2基因片段。 4.100μg/ml、150μg/ml絲裂霉素滅活LCLs后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞增殖明顯被抑制,24h后反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),細(xì)胞停止增殖。 5. DC-EBV-CTL體外殺傷鼻咽癌細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞24h,殺傷率分別為77.15%±3.18%,58.72%±6.30%,同時(shí)IFN-γ的分泌量為491.244±23.80pg/ml; LCLs-EBV-CTL對(duì)鼻咽癌細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞的殺傷率分別72.72%±8.45%、75.6%；殺傷過(guò)程中LCLs-EBV-CTL中分泌IFN-γ的細(xì)胞比例為25.04%,增加了12.3倍。結(jié)論 1.1640+10%FBS與GT-T551+2%自體血漿兩種培養(yǎng)基可以很好地促進(jìn)細(xì)胞的增殖,選擇1640+10%FBS作為下一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中T淋巴細(xì)胞的完全培養(yǎng)基。 2.制備的DC具有典型的形態(tài)學(xué)特征,細(xì)胞表面高度表達(dá)CD83、CD86分子,提示為成熟DC細(xì)胞,具備抗原提呈能力。 3.LCLs構(gòu)建成功,高度表達(dá)細(xì)胞表面分子CD40、CD19、CD80、CD86,提示細(xì)胞來(lái)源于B淋巴細(xì)胞,具備抗原提呈能力；RT-PCR成功擴(kuò)增LMP1、LMP2基因片段,證明細(xì)胞轉(zhuǎn)化成功,可作為APC提呈EBV特異性抗原。 4.誘導(dǎo)生成的DC-EBV-CTL、LCLs-EBV-CTL對(duì)EBV陽(yáng)性的鼻咽癌細(xì)胞及淋巴瘤細(xì)胞具有高度特異性殺傷作用,兩種EBV-CTL在抗原再次刺激后均可以分泌大量的IFN-γ,間接影響免疫反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：EB病毒 潛伏膜蛋白 樹(shù)突狀細(xì)胞 永生化淋巴母細(xì)胞 細(xì)胞毒性T細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.6
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-15
• 研究一 DC細(xì)胞的制備及生物學(xué)功能研究15-31
• 材料與方法15-23
• 結(jié)果23-28
• 小結(jié)28-31
• 研究二 LCLs細(xì)胞系的構(gòu)建及生物學(xué)特性鑒定31-50
• 材料與方法31-41
• 結(jié)果41-47
• 小結(jié)47-50
• 討論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 綜述57-66
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 附錄166-67
• 附錄267-68
• 致謝68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 徐瑞鳳;石敏;尤長(zhǎng)宣;呂成偉;羅榮城;廖旺軍;;負(fù)載LMP-1基因的樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)CTL對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)[J];河北醫(yī)學(xué);2010年12期

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本文編號(hào)：646643