本文關(guān)鍵詞：慢病毒載體介導(dǎo)mTOR沉默對體外人晶狀體上皮細(xì)胞作用的研究

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【摘要】：目的： 后發(fā)性白內(nèi)障(after cataract)也稱為后囊膜混濁(posterior capsule opacification，PCO)，是白內(nèi)障行超聲乳化術(shù)或者囊外摘除聯(lián)合人工晶狀體植入術(shù)后最常見的并發(fā)癥，也是術(shù)后引起視力再次降低的主要原因[1]。實(shí)驗(yàn)已證實(shí)術(shù)后殘留的前囊膜或赤道部晶狀體上皮細(xì)胞增殖、向后囊膜表面移行并有上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelialmesenchymal transition,EMT)是PCO發(fā)生的主要原因。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長增殖的信號匯聚點(diǎn)[2]。mTOR的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附與移行，加快細(xì)胞增殖，參與上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，引起諸多生物改變[3]�；虺聊煼�(RNA interference,RNAi)是近年來十分熱門的基因阻斷技術(shù)，因其特異性強(qiáng)、效率高的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛利用。本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒為載體，篩選出效率最高的含有特異性抑制mTOR靶點(diǎn)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人晶狀體上皮細(xì)胞中（Human Lens Epithelial Cell，HLEC），獲得持續(xù)低mTOR穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。觀察mTOR抑制后HLEC的增殖、凋亡及細(xì)胞周期的變化，同時觀察HLEC上皮細(xì)胞標(biāo)志物上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin,E-cad)和間質(zhì)標(biāo)志物平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscle actin，a-SMA)的表達(dá)改變。該研究旨在進(jìn)一步探討利用RNA干擾技術(shù)成功沉默mTOR基因后對HLEC功能及細(xì)胞表型變化的影響，從而進(jìn)一步在基因水平尋找針對后發(fā)障的預(yù)防治療方法。 研究方法： 1.合成特異性抑制mTOR的shRNA重組質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞獲得具有表達(dá)相應(yīng)性狀的感受態(tài)細(xì)胞。常規(guī)方法抽提各種質(zhì)粒溶液-20℃保存?zhèn)溆谩?2.按照比例加入質(zhì)粒及PEI，充分反應(yīng)后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。同時設(shè)置空白質(zhì)粒、PBS緩沖液為兩組對照組。多個時間點(diǎn)抽提培養(yǎng)液，無菌濾過收集，4℃保存即用。 3.將三個時間點(diǎn)收集到的抗mTOR慢病毒上清液等比混合，混合液按1：2體積加入融合度為80%的HLEC培養(yǎng)液中，24h換液后二次感染，48h后重復(fù)感染。陰性對照、空白對照亦按照1：2的體積分別加入融合度約為80%的HLEC的培養(yǎng)基中。24h、48h后兩次重復(fù)感染。 4.收集各組細(xì)胞蛋白，Western blot在蛋白質(zhì)水平檢測mTOR表達(dá)量，分析抑制效率。在多組抗mTOR shRNA中篩選出抑制效率最高的一組。 5. RT-PCR、Western blot對篩選出來的已成功感染的人晶狀體上皮細(xì)胞進(jìn)行a-SMA、E-cadherin表達(dá)量的檢測，與對照組比較。同時行CCK8檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞檢測儀檢測細(xì)胞周期變化，均與對照組比較，結(jié)果使用統(tǒng)計(jì)軟件分析。 結(jié)果： 1.制備重組質(zhì)粒GV248.mTORshRNA，，測序結(jié)果顯示目的核苷酸序列已與質(zhì)粒成功連接。 2.光學(xué)顯微鏡下293T細(xì)胞生長狀態(tài)良好，熒光顯微鏡下觀察到實(shí)驗(yàn)組大部分293T細(xì)胞核內(nèi)極亮綠色熒光，表達(dá)穩(wěn)定。對照組細(xì)胞無綠色熒光。 3.實(shí)驗(yàn)組mTOR均比含空白靶點(diǎn)的陰性對照和正常細(xì)胞的表達(dá)量低，有兩組幾乎檢測不到mTOR的表達(dá)，抑制效率較滿意。 4.抑制效率最高的實(shí)驗(yàn)組RT-PCR、Western blot檢測a-SMA表達(dá)比兩組對照組明顯減少，E-cadherin表達(dá)輕微上升，說明抑制mTOR表達(dá)一定程度上逆轉(zhuǎn)了EMT。 5.抑制效率最高組行CCK8檢測顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速率明顯比對照組減慢（p0.05）。 6.流式細(xì)胞儀檢測到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期大多停留在G1期，與對照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05），多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)通過重組質(zhì)粒GV248.mTORshRNA的制備，經(jīng)由感染作用實(shí)現(xiàn)了體外對人晶狀體上皮細(xì)胞中mTOR的表達(dá)的抑制。從而為闡述后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生及對其的特異性治療手段提供了基本的實(shí)驗(yàn)支持。 2.構(gòu)建慢病毒載體感染宿主細(xì)胞可作為長期穩(wěn)定抑制靶基因的有效方法之一。 3.特異性抑制mTOR可以在一定程度的逆轉(zhuǎn)人晶狀體上皮細(xì)胞中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，同時可以減緩細(xì)胞增殖，延長細(xì)胞周期，多點(diǎn)共同作用可作為防治后發(fā)障的潛在靶點(diǎn)之一。
【關(guān)鍵詞】：shRNA 慢病毒載體 mTOR 后發(fā)性白內(nèi)障 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R776.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 英文縮略詞對照表9-10
• 前言10-14
• 參考文獻(xiàn)12-14
• 第一部分 重組質(zhì)粒 GV248.mTOR~(shRNA)的構(gòu)建及慢病毒包裝14-26
• 一、材料和方法14-20
• 二、結(jié)果20-23
• 討論23-25
• 參考文獻(xiàn)25-26
• 第二部分 慢病毒感染體外 HLEC 觀察其形態(tài)功能及相關(guān)分子標(biāo)記的改變26-41
• 一、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、儀器、試劑與實(shí)驗(yàn)方法26-28
• 二、實(shí)驗(yàn)方法28-32
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-38
• 討論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-41
• 結(jié)論41-42
• 綜述一42-49
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 綜述二49-56
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 在讀期間發(fā)表論文情況56-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 鄒玉平,馮波;后囊膜混濁的研究現(xiàn)狀[J];國外醫(yī)學(xué).眼科學(xué)分冊;2001年05期

2 孫靖;后囊混濁的形成及藥物防治[J];國外醫(yī)學(xué).眼科學(xué)分冊;2001年05期

3 許麗疆;徐國興;;后發(fā)性白內(nèi)障防治的研究[J];國際眼科雜志;2012年10期

4 Cheng Pei;Yi Xu;Jean Xin.Jiang;Li-Jun Cui;Li Li;Li Qin;;Application of sustained delivery microsphere of cyclosporine A for preventing posterior capsular opacification in rabbits[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2013年01期

5 Na Cai;Shun-Dong Dai;Ning-Ning Liu;Li-Min Liu;Ning Zhao;Lei Chen;;PI3K/AKT/mTOR signaling pathway inhibitors in proliferation of retinal pigment epithelial cells[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2012年06期

6 儲昭節(jié);高丹宇;;飛秒激光輔助的白內(nèi)障手術(shù)新進(jìn)展[J];國際眼科雜志;2013年07期

7 孫靜;孫強(qiáng)明;李建芳;李彥涵;烏美妮;廖蕓;王晶晶;胡云章;;EB病毒BHRF1基因慢病毒載體的構(gòu)建及功能鑒定[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2013年06期

8 胡新華;楊軍;張志深;劉程偉;楊德華;張強(qiáng);;反義mTOR基因局部轉(zhuǎn)染對移植靜脈內(nèi)膜增生的影響[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2007年02期

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本文編號：629199