本文關(guān)鍵詞：CNTF基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞對視神經(jīng)鉗夾傷大鼠RGCs的保護作用

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【摘要】：目的研究經(jīng)慢病毒介導(dǎo),大鼠睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)對SD大鼠視神經(jīng)鉗夾傷(Optic nerve crush,ONC)模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(Retinal ganglion cells,RGCs)的保護作用。 方法 1、CNTF-BMSCs的體外構(gòu)建：全基因合成含信號肽的大鼠CNTF基因編碼序列并克隆至pHIV-dTomato慢病毒載體質(zhì)粒,構(gòu)建重組質(zhì)粒CNTF-dTomato. CNTF-dTomato/pHIV-dTomato與慢病毒輔助質(zhì)粒psPAX2及pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細胞進行慢病毒包裝,獲得重組慢病毒CNTF-lenti及control-lenti.以CNTF-lenti/control-lenti感染SD大鼠BMSCs,構(gòu)建CNTF-BMSCs及空載-BMSCs細胞,根據(jù)紅色熒光蛋白dTomato表達情況確定病毒感染效率；未感染lenti的BMSCs為空白-BMSCs.ELISA法測定空白-BMSCs、空載-BMSCs及CNTF-BMSCs細胞培養(yǎng)液中CNTF的質(zhì)量濃度。將CNTF-BMSCs向成骨和成脂方向誘導(dǎo)分化,以茜素紅染色和油紅-O染色對分化細胞進行鑒定。 2、ONC大鼠模型建立及實驗動物分組：60只成年雄性SD大鼠隨機分為空白對照組(A組)、手術(shù)對照組(B組)、PBS治療組(C組)、空白-BMSCs治療組(D組)、空載-BMSCs治療組(E組)和CNTF-BMSCs治療組(F組),每組各10只；B～F組均雙眼建立ONC模型,夾傷后立即向C-F組大鼠玻璃體腔內(nèi)注射相應(yīng)液體各10μL。 3、玻璃體腔注射CNTF-BMSCs對ONC作用的觀察：損傷后第14d處死各組大鼠,摘除雙眼眼球。石蠟切片HE染色法觀察大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)變化,計數(shù)視網(wǎng)膜節(jié)細層細胞數(shù)。免疫熒光染色檢測CNTF蛋白在視網(wǎng)膜的定位和表達情況。Westernblot法檢測視網(wǎng)膜內(nèi)Caspase-3和Brn3a蛋白的表達,照片掃描后采用Image J軟件處理,計算各蛋白相對表達率。 結(jié)果 1、CNTF-BMSCs構(gòu)建成功：質(zhì)粒測序結(jié)果顯示CNTF-dTomato質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組慢病毒對BMSCs的感染率達95%。ELISA檢測結(jié)果顯示,感染后第1、2、3、7d,CNTF-BMSCs組細胞上清液中CNTF蛋白的質(zhì)量濃度明顯高于空白-BMSCs組及空載-BMSCs組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均=0.000):CNTF-BMSCs組感染后2、3、7d細胞上清液中CNTF質(zhì)量濃度均明顯高于感染后1d,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.013,0.004,0.042)。CNTF-BMSCs經(jīng)成脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)后分化的細胞油紅-O染色呈紅色染色,經(jīng)成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)后分化的細胞茜素紅染色可見橘紅染色。 2、成功建立ONC大鼠模型：HE染色結(jié)果顯示,夾傷后14dB組、C組大鼠視網(wǎng)膜RGCs大量丟失,空泡化嚴重,細胞排列紊亂,顯示ONC模型成功建立。D、E、F組大鼠視網(wǎng)膜RGCs空泡化減輕,細胞排列較整齊。 3、CNTF-BMSCs對RGCs的保護作用：節(jié)細胞層細胞計數(shù)結(jié)果顯示,夾傷后14dB組、C組大鼠節(jié)細胞層細胞數(shù)較A組大幅減少,D、E、F組大鼠節(jié)細胞層細胞數(shù)高于B、C二組(P均0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示,夾傷后14dA組大鼠視網(wǎng)膜各層均無CNTF表達,F組視網(wǎng)膜節(jié)細胞層CNTF大量表達,其他各組視網(wǎng)膜節(jié)細胞層見少量CNTF表達。Western blot圖片處理結(jié)果顯示,夾傷后14dF組活性Caspase-3相對表達率低于其他各組(P均=0.000)；Bm3a相對表達率低于A組,高于其他各組(P均0.05)。 結(jié)論利用慢病毒載體可成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達分泌型CNTF蛋白的大鼠BMSCs。玻璃體腔內(nèi)注射CNTF-BMSCs可有效減少大鼠視神經(jīng)鉗夾傷后RGCs的丟失,對RGCs具有明顯的保護作用。
【關(guān)鍵詞】：睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子 慢病毒載體 骨髓間充質(zhì)干細胞 視神經(jīng)鉗夾傷 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R779.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、CNTF基因修飾的大鼠BMSCs的構(gòu)建15-29
• 1.1 對象和方法15-17
• 1.1.1 細胞、菌種與質(zhì)粒15
• 1.1.2 主要試劑15-16
• 1.1.3 主要儀器、耗材16
• 1.1.4 主要溶液及緩沖液16-17
• 1.2 實驗方法及流程17-23
• 1.2.1 大鼠BMSCs培養(yǎng)17-18
• 1.2.2 慢病毒穿梭質(zhì)粒CNTF-dTomato的構(gòu)建18-19
• 1.2.3 慢病毒的包裝19-20
• 1.2.4 病毒原液的收獲和濃縮20
• 1.2.5 重組慢病毒感染BMSCs20-21
• 1.2.6 CNTF蛋白表達檢測21-22
• 1.2.7 CNTF-BMSCs誘導(dǎo)分化22
• 1.2.8 CNTF-BMSCs分化潛能的鑒定22
• 1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析方法22-23
• 1.3 實驗結(jié)果23-27
• 1.3.1 慢病毒穿梭質(zhì)粒CNTF-dTomato測序結(jié)果23-24
• 1.3.2 重組慢病毒感染BMSCs的熒光鑒定24
• 1.3.3 各組BMSCs不同時間細胞上清液中目的蛋白CNTF質(zhì)量濃度24-26
• 1.3.4 CNTF-BMSCs分化為成骨細胞和脂肪細胞的鑒定26-27
• 1.4 討論27-28
• 1.4.1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病干細胞及神經(jīng)營養(yǎng)因子治療27
• 1.4.2 分泌型CNTF的表達27-28
• 1.5 小結(jié)28-29
• 二、CNTF基因修飾的BMSCs對大鼠RGCs的保護作用29-47
• 2.1 對象和方法29-33
• 2.1.1 實驗動物及分組29
• 2.1.2 主要試劑29-30
• 2.1.3 主要儀器、耗材30-31
• 2.1.4 主要溶液及緩沖液31-33
• 2.2 實驗方法33-39
• 2.2.1 ONC動物模型建立及玻璃體腔內(nèi)給藥33-34
• 2.2.2 注射細胞在眼內(nèi)定位情況的觀察34
• 2.2.3 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察34-35
• 2.2.4 視網(wǎng)膜內(nèi)CNTF表達檢測35-36
• 2.2.5 視網(wǎng)膜組織蛋白提取36
• 2.2.6 BCA法測定蛋白濃度36-37
• 2.2.7 視網(wǎng)膜內(nèi)Caspase-3、Brn-3a蛋白表達水平檢測37-39
• 2.3 實驗結(jié)果39-44
• 2.3.1 注射細胞眼內(nèi)定位39
• 2.3.2 視網(wǎng)膜節(jié)細胞層細胞數(shù)變化39-40
• 2.3.3 視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變40-41
• 2.3.4 CNTF蛋白在視網(wǎng)膜的定位及表達41-43
• 2.3.5 視網(wǎng)膜Caspase-3、Brn3a蛋白表達43-44
• 2.4 討論44-46
• 2.4.1 RGCs損傷模型44-45
• 2.4.2 CNTF-BMSCs對RGCs的保護作用45-46
• 2.4.3 CNTF-BMSCs抑制Caspase-3活化46
• 2.5 小結(jié)46-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻48-53
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明53-54
• 綜述 CNTF治療視網(wǎng)膜損傷研究進展54-64
• 綜述參考文獻60-64
• 致謝64

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：548015