本文關(guān)鍵詞：螺內(nèi)酯與纈沙坦對氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜病變新生血管抑制作用及機制的初步探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity, ROP)是一種發(fā)生于早產(chǎn)兒的增殖性視網(wǎng)膜病變,在此病變中視網(wǎng)膜血管病變是導(dǎo)致患兒視力損害甚至失明的主要原因之一。近年來隨著我國圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和新生兒學(xué)的快速發(fā)展,早產(chǎn)兒、低出生體重兒經(jīng)搶救存活率明顯提高,ROP的發(fā)生率也相應(yīng)增加,嚴重影響了早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量,也使近年來因ROP引起的醫(yī)療糾紛呈逐年增多之勢。ROP的發(fā)病機制尚未闡明,已有的研究表明發(fā)育未成熟的視網(wǎng)膜血管對氧極為敏感,高濃度氧使視網(wǎng)膜血管收縮甚至阻塞,引起視網(wǎng)膜細胞缺少氧氣和養(yǎng)料供給。由于缺氧而產(chǎn)生促血管增生因子,從而刺激視網(wǎng)膜發(fā)生新生血管。ROP新生血管多發(fā)生在以顳側(cè)為代表的視網(wǎng)膜的周邊部,病理性新生血管由視網(wǎng)膜內(nèi)層萌芽,并且逐漸由內(nèi)而外向視網(wǎng)膜表面生長,甚者延伸生長入玻璃體腔內(nèi)。新生血管大多伴有異常纖維組織增生,沿玻璃體前面生長的異常纖維血管膜在晶體后方形成晶體后纖維膜,一旦纖維膜收縮,則周邊部視網(wǎng)膜被拉向眼球中心,導(dǎo)致牽引性視網(wǎng)膜脫離,最后造成不可逆性眼球萎縮、失明。因此在ROP的病理生理過程中,新生血管的形成起著主導(dǎo)作用。新生血管的生成是一個復(fù)雜的眾多促血管生成因子之間相互作用的結(jié)果。在正常情況下,血管生成物質(zhì)與抗血管生成物質(zhì)達到平衡時,血管生成的過程暫停,若有病理性因素改變這一平衡,促進血管生成物質(zhì)增多,則血管生成過程開啟,形成新生血管。 目前對該病的治療主要有手術(shù)治療,如視網(wǎng)膜光凝、冷凝、玻璃體切割術(shù)等方法,但治療效果不佳�；趯OP中視網(wǎng)膜新生血管發(fā)病機制認識的不斷深入,視網(wǎng)膜新生血管的藥物治療無疑成為一種頗具潛力治療的方法,積極探索能通過作用于血管生成和炎癥路徑的治療方法是早期ROP非手術(shù)治療方法的當務(wù)之急。 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin. angiotensin system, RAS)不僅是一個典型的內(nèi)分泌系統(tǒng),而且是一個自分泌與旁分泌系統(tǒng),由腎素、血管緊張素及其受體組成。完整的RAS系統(tǒng)存在于人類和多種生物的視網(wǎng)膜中,并且被發(fā)現(xiàn)存在于發(fā)育中的視網(wǎng)膜內(nèi)。先前研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1)和血管緊張素Ⅱ2型受體(AT2)在視網(wǎng)膜神經(jīng)層和色素上皮層及葡萄膜組織中比血漿中高5-100倍,這表明眼組織中高濃度的AT1, AT2并非來源于血循環(huán)。眼組織中的RAS獨立于血循環(huán)而存在,RAS大量存在于視網(wǎng)膜血管和內(nèi)層視網(wǎng)膜的神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞中。Kida T等發(fā)現(xiàn)RAS的主要成分——血管緊張素和腎素存在于視網(wǎng)膜無長突細胞和神經(jīng)節(jié)細胞,后者還存在于Muller細胞中。腎素-血管緊張素抑制劑包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin—converting enzyme, ACE)抑制劑、血管緊張素ⅡⅡ受體拮抗劑(angiotensin II receptor blockers, ARB)、醛固酮拮抗劑等,具有抗高血壓、抗心衰、抗腎功能不全、抗糖尿病等多種生物學(xué)作用。近期研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑具有防止和減弱ROP視網(wǎng)膜新生血管病理性生成的作用,但對于醛固酮拮抗劑用于ROP視網(wǎng)膜新生血管的報道比較少。在醛固酮腺瘤中,血管生成量與醛固酮成正相關(guān)。在角膜微囊袋法和后肢缺血模型中,螺內(nèi)酯抑制新生血管生成。醛固酮的分泌主要受腎素-血管緊張素調(diào)節(jié),那么眼組織中是否存在MR-醛固酮系統(tǒng)獨立的表達,在視網(wǎng)膜血管發(fā)育中,醛固酮可否發(fā)生著作用,這一問題尚未見相關(guān)文獻報道。本實驗利用氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜病變模型(OIR)模擬ROP,分別采用醛固酮拮抗劑螺內(nèi)酯與ARB纈沙坦腹腔注射干預(yù),通過對小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)及其VEGF和MCP-1表達的觀察,初步探討其作用。在對視網(wǎng)膜新生血管形態(tài)的切片觀察中,我們發(fā)現(xiàn)固定液種類繁多,必須選擇一種能夠較好的固定視網(wǎng)膜并且避免固定液性視網(wǎng)膜脫離的眼球固定液�，F(xiàn)有報道的眼球固定液中多為用來觀察角膜晶狀體等部分,而對于視網(wǎng)膜的固定液未見明確報道,因此我們比較了四種已有的固定液對小鼠的視網(wǎng)膜固定作用。 基于以上分析,本研究主要由兩部分展開,第一部分觀察四種不同復(fù)合固定液對小鼠視網(wǎng)膜的固定效果,并進行比較分析,選擇出理想的視網(wǎng)膜固定液,為進一步實驗打好基礎(chǔ)；第二部分在第一部分研究的基礎(chǔ)上觀察醛固酮抑制劑是否同血管緊張素Ⅱ抑制劑一樣,可以抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成,同時探討其抑制作用可能的機制。 第一部分四種不同復(fù)合固定液對小鼠視網(wǎng)膜固定作用比較 目的 觀察四種不同復(fù)合固定液對小鼠視網(wǎng)膜的固定效果,并進行比較分析,選擇安全有效的固定液進行第二部分的實驗中的視網(wǎng)膜固定,為視網(wǎng)膜的固定提供實驗依據(jù)和臨床應(yīng)用。 方法 40只昆明小鼠隨機平均分到A-D四組,腹腔過度麻醉處死后,立即摘除眼球,每組共包含10只小鼠的20只眼球。A組浸泡于固定液1(多聚甲醛4g,加入0.1mol/L磷酸緩沖液80mL,加熱至60℃左右,持續(xù)攪拌,使粉末完全溶解,加少許1nol/LNaOH澄清。待溶液冷卻后,,依次加冰醋酸5mL、丙酮10mL,用0.1mol/L磷酸緩沖液補足至總?cè)萘?00mL)；B組使用固定液2(5%重鉻酸鉀40mL、10%甲醛10mL、冰醋酸10mL、三氯醋酸10mL、10%醋酸鈉10mL的混合溶液)；C組浸泡于固定液3(冰醋酸10mL、40%甲醛溶液20mL、生理鹽水70mL、75%酒精10mL的混合溶液)固定；D組浸泡于固定液4(無水乙醇60mL、40%甲醛溶液10mL、冰醋酸10mL、氯仿20mL的混合溶液)。固定液均沒過小鼠眼球,使小鼠眼球能夠得到充分浸泡。固定24小時候進行常規(guī)脫水、石蠟包埋固定、HE染色。 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,對數(shù)據(jù)進行卡方檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 肉眼可見A組、B組小鼠眼球可見部分視杯凹陷皺縮,不能保持原有形態(tài)；C組、D組小鼠眼球外形圓滑,色澤亮白透明,眼杯形狀未見明顯皺縮凹陷等變形,眼球形狀基本保持原有狀態(tài)。切片時,A、B組較難得出完整切片；C組所得切片結(jié)構(gòu)不清晰；D組的切片較為完整。 視網(wǎng)膜HE染色可見A組小鼠視網(wǎng)膜各層組織均有不同程度斷裂,部分組織結(jié)構(gòu)缺失,視網(wǎng)膜各層組織間隙較大。組織細胞結(jié)構(gòu)疏松,細胞均明顯著色,細胞固縮,染色質(zhì)顏色偏暗,各層顏色對比較明顯；B組小鼠視網(wǎng)膜各層分離,組織斷裂,組織缺失。視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)間存在裂隙。組織細胞間龜裂變形,組織間隙增大,細胞收縮,著色加深,細胞內(nèi)組織結(jié)構(gòu)顏色對比不明顯；C組小鼠視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)較清晰,色澤可,各層組織結(jié)構(gòu)完整,細胞結(jié)構(gòu)較清晰,但可見固定液性視網(wǎng)膜分離；D組小鼠視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)完整,無明顯結(jié)構(gòu)改變,未見視網(wǎng)膜的脫落和分離,眼球各層組織結(jié)構(gòu)清晰無裂隙。組織細胞間無龜裂變形,無細胞過度收縮和膨脹,未見組織的自溶；細胞核仁、核膜清晰,染色質(zhì)均勻,色澤亮麗,顏色對比明顯。 各組間數(shù)據(jù)采用卡方檢驗,各組眼球收縮比有顯著差異(卡方值為34.687,P0.05),各組眼球硬化比有顯著差異(卡方值為34.972,P0.05),各組固定液性網(wǎng)脫發(fā)生比有顯著差異(卡方值為49.048,P0.05) 結(jié)論 經(jīng)過固定液4固定的視網(wǎng)膜組織可以清晰看到視網(wǎng)膜各層且罕見固定液性視網(wǎng)膜脫離。加入能與乙醇、冰醋酸互溶的氯仿能有效促進固定液的眼球滲透,降低了固定液性視網(wǎng)膜脫離。 第二部分螺內(nèi)酯與纈沙坦對氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管抑制作用的觀察 目的 觀察螺內(nèi)酯與纈沙坦對氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜病變模型視網(wǎng)膜中新生血管的抑制作用,探討其對VEGF、MCP-1蛋白及mRNA表達變化的影響。方法 C57BL/6J新生小鼠60只,隨機分為A-F六組,每組10只。A、B組新生小鼠置于正�？諝猸h(huán)境中與其母鼠一同飼養(yǎng)。C、D、E、 F四組7日齡新生小鼠與其母鼠放入特定氧箱中,制造氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型。在日齡12-18天時,A、C組新生小鼠不做處理,B、D組新生小鼠腹腔注射溶劑2.5ml/(Kg·d),E組新生小鼠腹腔注射螺內(nèi)酯25mg/(Kg·d), F組新生小鼠腹腔注射纈沙坦10mg/(Kg·d)。干預(yù)一周后取各組小鼠視網(wǎng)膜標本,行視網(wǎng)膜切片HE染色觀察新生血管生長情況,利用Western-Blot和RT-PCR技術(shù)檢測VEGF、MCP-1表達變化,觀察其對視網(wǎng)膜病理性新生血管抑制作用。 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,實驗測試指標的數(shù)據(jù)資料以MEAN±SD表示；對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA),P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果 視網(wǎng)膜HE染色可見A、B組組視網(wǎng)膜各層細胞整齊排列,內(nèi)界膜走形平滑,不見或較少見血管內(nèi)皮細胞突破內(nèi)界膜；C組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜內(nèi)可見大量血管內(nèi)皮細胞,甚至可見血管內(nèi)皮細胞團,血管擴張,可見玻璃體腔內(nèi)新生血管及出血；D組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜內(nèi)可見大量血管內(nèi)皮細胞,甚至可見血管內(nèi)皮細胞團,血管擴張,可見玻璃體腔內(nèi)新生血管及出血,未見與C組形態(tài)明顯不同；E組視網(wǎng)膜各層細胞排列較整齊,可見中等量血管內(nèi)皮細胞突破內(nèi)界膜；F組視網(wǎng)膜各層細胞排列較整齊,可見少量血管內(nèi)皮細胞突破內(nèi)界膜。 突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞計數(shù)：A組為3.23±2.192,B組2.7±1.915,C組49.90±4.809,D組50.17±5.140,E組25.70±3.415,F組7.20±3.478；各組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=1109.859,P=0.00)；兩組間比較A組與B組(P=0.995),C組與D組(P=1)間未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異,其余各組間可見較明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P均0.05)。 Western blot及RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)六組小鼠視網(wǎng)膜中均有MCP-1蛋白及mRNA的表達,且其波動呈現(xiàn)一致性。兩指標各組間比較均有有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。VEGF在正常對照組(A組、B組)視網(wǎng)膜中表達微弱,而在OIR模型組(C組、D組)視網(wǎng)膜中表達顯著上調(diào),與正常對照比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；E組、F組與OIR模型組比較VEGF表達下調(diào),且F組降低較E組顯著,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。同樣檢測方法發(fā)現(xiàn)六組視網(wǎng)膜中均有VEGF蛋白及mRNA表達,且其波動呈現(xiàn)一致性。兩指標各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。VEGF在正常對照組(A組、B組)視網(wǎng)膜中表達微弱,而在OIR模型組(C組、D組)視網(wǎng)膜中表達顯著上調(diào),與正常對照比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；E組、F組與OIR模型組比較VEGF表達下調(diào),且F組降低較E組顯著,具有顯著差異(P0.05)。 結(jié)論 1.小鼠視網(wǎng)膜中可能存在獨立的腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)； 2.螺內(nèi)酯與纈沙坦均可通過抗炎、抗血管內(nèi)皮細胞生長因子途徑抑制氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜病變中病理性新生血管； 3.在本實驗所使用藥物劑量下,纈沙坦螺比內(nèi)酯抑制視網(wǎng)膜新生血管的作用更強,這可能與纈沙坦不僅能夠阻滯醛固酮途徑抑制新生血管,亦能夠阻滯血管緊張素Ⅱ的促新生血管生成作用有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：螺內(nèi)酯 纈沙坦 視網(wǎng)膜新生血管 單核細胞趨化蛋白-1 血管內(nèi)皮細胞生長因子
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R774.1
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-23
• 參考文獻20-23
• 第一章 四種不同復(fù)合固定液對小鼠視網(wǎng)膜固定作用比較23-37
• 背景內(nèi)容23
• 1 實驗材料23-25
• 2 實驗方法25-26
• 3 實驗結(jié)果26-32
• 4 討論32-34
• 5 參考文獻34-37
• 第二章 螺內(nèi)酯與纈沙坦對氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管抑制作用的觀察37-68
• 背景內(nèi)容37
• 1 實驗材料37-45
• 2 實驗方法45-51
• 3 實驗結(jié)果51-60
• 4 討論60-65
• 5 參考文獻65-68
• 全文總結(jié)與展望68-70
• 攻讀學(xué)位期間成果70-71
• 致謝71-72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馬吉獻，于純智，，張廷，楊良戶;眼球固定液的配制及應(yīng)用[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1994年04期

2 謝玲;張志平;林堅濤;王以堯;;小魚眼球視網(wǎng)膜組織石蠟切片的制作方法[J];廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2007年05期

3 陸明深;陳罡;;臨床眼球標本切片制作方法改良[J];華夏醫(yī)學(xué);2010年05期

4 常永杰;馬長路;;冰凍切片法制作豚鼠眼球切片[J];中原醫(yī)刊;2006年08期

5 盛[;王輝;陸Y罾

本文編號：389088