本文關(guān)鍵詞：在體生物發(fā)光成像術(shù)觀察骨髓來源細(xì)胞參與脈絡(luò)膜新生血管的形成，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）為年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）等多種眼底疾病視力喪失的主要原因。在CNV進(jìn)程中血管發(fā)生和血管生成同時(shí)發(fā)生，最終可導(dǎo)致嚴(yán)重且不可逆的視力喪失。CNV的發(fā)病機(jī)理還未完全闡明，涉及RPE-Bruch膜-光感受器復(fù)合體的衰老，氧化性損傷的積累以及外層視網(wǎng)膜局部缺血的發(fā)展。 我研究組前期實(shí)驗(yàn)通過建立C57-GFP嵌合體小鼠觀察了在CNV發(fā)生發(fā)展過程中，骨髓來源細(xì)胞（Bone marrow derived cells, BMCs）在CNV聚集、分化和表達(dá)蛋白情況，證實(shí)BMCs在CNV局部可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，這些細(xì)胞除了參與形成新生血管外，還可分泌促血管形成因子如VEGF和bFGF，表明BMCs也在一定程度上調(diào)控著CNV的嚴(yán)重程度。在相同強(qiáng)度的誘發(fā)因素下，高齡小鼠生成的CNV較低齡小鼠更為嚴(yán)重，提示我們年齡因素可能使BMCs對(duì)損傷做出超常反應(yīng)，從而導(dǎo)致病理性新生血管的生成更為嚴(yán)重。還有研究表明，高齡鼠骨髓細(xì)胞可能存在有功能異常，導(dǎo)致其分化能力發(fā)生改變，從而促進(jìn)生成病理性組織。近期有研究發(fā)現(xiàn)，高齡鼠BMCs的增殖能力受損，并有潛在的新生血管形成趨勢(shì)。在低氧預(yù)處理后，其血管生成基因表達(dá)增加，因此是否移植高齡者BMCs會(huì)影響其臨床治療潛力？ 組織病理學(xué)檢測(cè)是評(píng)價(jià)注射細(xì)胞分布、移植后成活率及其分化狀態(tài)的最主要方法，，但無法實(shí)時(shí)和在活體內(nèi)動(dòng)態(tài)進(jìn)行觀測(cè)和評(píng)價(jià)。生物發(fā)光成像技術(shù)（bioluminescenceimaging, BLI）可以在體、實(shí)時(shí)的示蹤各類細(xì)胞的存活、歸巢和分化情況，還可評(píng)估骨髓移植后受體的存活狀態(tài)和被移植細(xì)胞的存活狀態(tài)，是一項(xiàng)尤其適用于小動(dòng)物的新興分子影像學(xué)技術(shù)。 目的和內(nèi)容（1）評(píng)價(jià)BLI監(jiān)測(cè)小鼠體內(nèi)BMCs參與CNV形成過程的可行性，為BLI研究CNV發(fā)生機(jī)制打基礎(chǔ)；（2）利用BLI觀察不同年齡BMCs參與CNV形成的全過程并結(jié)合組織學(xué)分析，探究年齡如何影響B(tài)MCs參與形成CNV。 方法（1）將熒光素酶-綠色熒光蛋白（Fluc-GFP）雙轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓移植到野生型C57小鼠，將嵌合度＞85%的嵌合體小鼠并分為兩組：實(shí)驗(yàn)組利用532nm激光建立小鼠CNV模型，對(duì)照組不行CNV造模。于CNV建模后1天、3天、7天、14天、21天和28天，利用小動(dòng)物成像系統(tǒng)（IVIS Kinetics）對(duì)兩組小鼠進(jìn)行BLI觀察，高靈敏度CCD采集圖像，活體成像軟件系統(tǒng)（Living Imaging Version4.0）對(duì)選取的眼部光學(xué)統(tǒng)計(jì)區(qū)域（Regions of interest, ROIs）進(jìn)行分析。（2）小鼠分為兩組，年齡性別匹配，實(shí)驗(yàn)組為Fluc-GFP雙轉(zhuǎn)基因老年小鼠（18月齡）與野生型C57成年小鼠（4月齡）的骨髓移植建立的CNV嵌合體小鼠，對(duì)照組為Fluc-GFP雙轉(zhuǎn)基因成年小鼠（4月齡）與野生型C57成年小鼠（4月齡）的骨髓移植建立的CNV嵌合體小鼠。將嵌合度＞85%的嵌合體小鼠納入實(shí)驗(yàn)，利用532nm激光建立兩組小鼠CNV模型。于CNV建模后1天、3天、7天、14天、21天和28天，利用小動(dòng)物成像系統(tǒng)（IVIS Kinetics）對(duì)兩組小鼠進(jìn)行BLI觀察，高靈敏度CCD采集圖像，活體成像軟件系統(tǒng)（Living Imaging Version4.0）對(duì)選取的眼部光學(xué)統(tǒng)計(jì)區(qū)域（Regions of interest,ROIs）進(jìn)行分析。擇激光后第14天為組織學(xué)實(shí)驗(yàn)的觀察點(diǎn)，從組織學(xué)角度分析CNV區(qū)域的BMCs，兩組小鼠同步進(jìn)行，利用圖像分析軟件(Photoshop cs4)來測(cè)量各個(gè)樣本中CNV的最大直徑和厚度，以像素（pixel）為單位進(jìn)行表示。 結(jié)果（1）造模后第1天，實(shí)驗(yàn)組小鼠即有大量BMCs趨化至CNV部位，前3天趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量增長(zhǎng)最快，第7天病變部位BMCs數(shù)量達(dá)峰值，第14天病變部位BMCs數(shù)量降至最低，隨后稍有增加，第28天以后保持穩(wěn)定。對(duì)照組小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)眼內(nèi)BMCs數(shù)量較為穩(wěn)定，且明顯低于實(shí)驗(yàn)組小鼠（P0.05）。（2）實(shí)驗(yàn)組小鼠（老年小鼠骨髓移植給成年小鼠）趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量在CNV建模后14天內(nèi)明顯高于成年小鼠骨髓移植給成年小鼠的對(duì)照組（P0.05），14天后兩組小鼠趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量無明顯差別（P＞0.05）。在CNV造模后的第1天至第7天，實(shí)驗(yàn)組小鼠趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量迅速上升，7天時(shí)達(dá)到峰值，7天至14天趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量直線下降，14天后降至對(duì)照組水平。對(duì)照組在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量較少且變化較慢，且3天后增長(zhǎng)速度下降，7天后趨化至CNV部位的BMCs數(shù)量即開始下降，到第14天降至最低水平。14天后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠眼部發(fā)光量無明顯差別，平行且穩(wěn)定變化，28天后，兩組小鼠眼部發(fā)光量均趨于穩(wěn)定。老年鼠骨髓移植給成年鼠的實(shí)驗(yàn)組小鼠無論是CNV厚度，還是CNV直徑都與成年鼠骨髓移植給成年鼠的對(duì)照組小鼠有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 結(jié)論利用BLI技術(shù)可以分析對(duì)比不同干細(xì)胞參與CNV的能力及其與CNV的相互影響。這種在活體內(nèi)實(shí)時(shí)、敏感的觀察各類干細(xì)胞生理病理活動(dòng)的技術(shù)將為研究CNV發(fā)生機(jī)制提供了一種新的客觀的輔助方法。
【關(guān)鍵詞】：脈絡(luò)膜新生血管 骨髓來源細(xì)胞 在體生物發(fā)光成像技術(shù) 年齡
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R773.4
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-34
• 第一部分 在體生物發(fā)光成像術(shù)觀察骨髓來源細(xì)胞參與脈絡(luò)膜新生血管的形成34-41
• 0 引言34-35
• 1 材料35-36
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物35
• 1.2 主要試劑35
• 1.3 儀器設(shè)備35-36
• 2 實(shí)驗(yàn)方法36-38
• 2.1 動(dòng)物分組36
• 2.2 BMCs 的采集36
• 2.3 骨髓移植36
• 2.4 嵌合度分析36-37
• 2.5 細(xì)胞的光學(xué)分析37
• 2.6 建立小鼠 CNV 模型37
• 2.7 BLI 觀察 BMCs 參與 CNV 情況37-38
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析38
• 3 結(jié)果38-39
• 3.1 BMCs 的形態(tài)38
• 3.2 嵌合度分析38
• 3.3 細(xì)胞的光學(xué)分析38
• 3.4 在體生物發(fā)光示蹤 BMCs 參與 CNV 情況38-39
• 4 討論39-41
• 第二部分 在體生物發(fā)光成像術(shù)觀察高齡骨髓來源細(xì)胞對(duì)脈絡(luò)膜新生血管形成的影響41-48
• 0 引言41-42
• 1 材料42
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物42
• 1.2 主要試劑42
• 1.3 儀器設(shè)備42
• 2 實(shí)驗(yàn)方法42-45
• 2.1 動(dòng)物分組42-43
• 2.2 BMCs 的采集43
• 2.3 骨髓移植43
• 2.4 嵌合度分析43
• 2.5 建立小鼠 CNV 模型43
• 2.6 BLI 觀察年齡對(duì) BMCs 參與 CNV 情況的影響43
• 2.7 組織學(xué)分析43-45
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析45
• 3 結(jié)果45-46
• 3.1 在體生物發(fā)光示蹤 BMCs 參與 CNV 情況45
• 3.2 組織學(xué)分析高齡 BMCs 對(duì) CNV 嚴(yán)重程度的影響45-46
• 4 討論46-48
• 小結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-70
• 附錄70-75
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果75-76
• 致謝76-77

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：379185